La despirogenación se refiere a la eliminación de pirógenos de la solución, más comúnmente de los productos farmacéuticos inyectables.
Un pirógeno se define como cualquier sustancia que pueda provocar fiebre. Los pirógenos bacterianos incluyen endotoxinas y exotoxinas , aunque muchos pirógenos son endógenos al huésped. Las endotoxinas incluyen moléculas de lipopolisacáridos (LPS) que se encuentran como parte de la pared celular de las bacterias gramnegativas y se liberan tras la lisis de las células bacterianas . Las endotoxinas pueden volverse pirógenas cuando se liberan en el torrente sanguíneo u otros tejidos donde no se encuentran normalmente. Aunque el colon contiene bacterias gramnegativas en abundancia, estas no causan un efecto pirogénico ya que las bacterias no sufren lisis macroscópica y el sistema inmunológico no está expuesto a endotoxinas libres mientras la pared colónica está intacta.
Cuando se libera LPS tras la lisis de células bacterianas, el componente lípido A se une primero a la proteína de unión a LPS (LBP) sérica y luego se transfiere a CD14 (ya sea CD14 libre en el suero o se une a la superficie celular de macrófagos o monocitos). Esto monomeriza el LPS agregado, ya que el receptor tipo Toll 4 del receptor de LPS (TLR4) no puede reconocer el LPS mientras está agregado. A continuación, el LPS monomérico se transfiere a MD-2 precomplejado con TLR4 en macrófagos y monocitos . Esto conduce a la liberación de citocinas proinflamatorias y óxido nítrico, que en última instancia pueden conducir a un choque séptico dependiendo de la fuerza de la respuesta. Las células endoteliales vasculares también expresan TLR4 y MD-2 y, por lo tanto, responden directamente a LPS, así como a través de citocinas y óxido nítrico. Las células epiteliales bronquiales y las células epiteliales colónicas también expresan TLR4, pero como no expresan MD-2, dependen de LPS precomplejado con MD-2 sérico para enviar señales a LPS.
Nivel máximo de endotoxinas aceptable
Debido a que el peso molecular de las endotoxinas puede variar mucho (10,000 a 1,000,000 Da), los niveles de endotoxinas se miden en "unidades de endotoxinas" (UE). Una UE equivale aproximadamente a 100 pg de lipopolisacárido de E. coli, la cantidad presente en alrededor de 105 bacterias. Los seres humanos pueden desarrollar síntomas cuando se exponen a tan solo 5 UE / kg de peso corporal. Estos síntomas incluyen, entre otros, fiebre, presión arterial baja, aumento de la frecuencia cardíaca y producción de orina baja; e incluso pequeñas dosis de endotoxina en el torrente sanguíneo a menudo son fatales.
La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos ha establecido los siguientes niveles máximos permisibles de endotoxinas para los medicamentos distribuidos en los Estados Unidos:
- Medicamento (inyectable, intratecal ) - 0,2 UE / kg de peso corporal
- Medicamento (inyectable, no intratecal) - 5 UE / kg de peso corporal
- Agua esterilizada: 0,25-0,5 EU / ml (depende del uso previsto)
Detección de pirógenos
Prueba de conejo
La detección temprana de endotoxinas se logró inyectando conejos con la muestra y observando la respuesta en su temperatura corporal. Los conejos tienen una tolerancia a endotoxinas similar a la de los humanos y, por lo tanto, eran una opción ideal. Sin embargo, este método era costoso, consumía mucho tiempo y provocó protestas de los defensores de los derechos de los animales. Pero quizás el mayor inconveniente de esta prueba fue su incapacidad para cuantificar el nivel de endotoxinas.
Prueba LAL
Actualmente, un método común para la detección de endotoxinas es la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Esta prueba se basa en la observación del Dr. Frederik Bang de que la sangre del cangrejo herradura forma coágulos cuando se expone a endotoxinas. [1] El extracto de amebocitos de sangre de cangrejo herradura se mezcla con una muestra sospechosa de contaminación por endotoxinas y se observa una reacción si hay endotoxinas presentes. La FDA ha aprobado cuatro variaciones de la prueba LAL: ensayo de gel-coágulo, turbidimétrico, colorimétrico y cromogénico. Las diferencias en estas variaciones se refieren a las características de la reacción amebocito / endtoxina (por ejemplo, el gel-coágulo produce un precipitado y cambia colorimétrico de color). Esta prueba es rápida (aproximadamente 30 minutos) y muy sensible (hasta 0,001 EU / ml de sensibilidad). Sin embargo, debido a que solo detecta endotoxinas LPS, se pueden pasar por alto algunos materiales pirogénicos. Además, ciertas condiciones (condiciones de pH subóptimas o concentración de cationes inadecuada ) pueden dar lugar a falsos negativos. Los glucanos de las matrices de cromatografía de carbohidratos también pueden dar lugar a falsos positivos. [2]
Desde 2003, se encuentra disponible comercialmente un sustituto sintético de la prueba LAL. Esta prueba de factor C recombinante (rFC) se basa en el factor de coagulación C de Limulus , la parte sensible a LPS de LAL. La adopción de esta prueba fue lenta, lo que comenzó a cambiar en 2016 cuando la Farmacopea Europea incluyó esta prueba como una prueba de toxina bacteriana aceptada. [3]
Prueba de activación de monocitos
La prueba de activación de monocitos (MAT) utiliza los monocitos en sangre humana in vitro para detectar pirógenos. Fue agregado a la Farmacopea Europea en 2010 y aceptado por la FDA en 2012. [4]
Eliminación de pirógenos (despirogenación)
Los pirógenos a menudo pueden ser difíciles de eliminar de la solución debido a la alta variabilidad de su peso molecular. Los pirógenos también son relativamente estables térmicamente e insensibles a los cambios de pH. Sin embargo, existen varias técnicas de eliminación. [5]
- Cromatografía de intercambio de iones
- Las endotoxinas están cargadas negativamente y se unirán a un intercambiador de aniones . Si la sustancia objetivo no está también cargada negativamente, pasará a través de la columna antes que la endotoxina y se podrá lograr una separación efectiva. Este método se utiliza a veces en la purificación de albúminas (se detallan a continuación). Los ligandos de afinidad conocida por las endotoxinas se pueden acoplar a un sistema de intercambio aniónico para aumentar su fuerza de unión a endotoxinas y mejorar aún más la pureza del producto final. Ejemplos típicos de endotoxina ligandos de unión incluyen la histamina , compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno, y polimixina B . Sin embargo, se sabe que la polimixina B induce la producción de interleucina-1, un pirógeno exógeno y, por lo tanto, debe demostrarse que está ausente en el producto final si se usa.
- Ejemplo de uso de cromatografía de intercambio aniónico para purificar la albúmina: [6]
- El 2% de la endotoxina no se une a la columna. Sin embargo, este 2% se elimina antes del pico de albúmina y, por lo tanto, se puede eliminar simplemente iniciando la recolección después de que este 2% se haya eliminado.
- El 10% de la endotoxina que se une a la columna (9,8% del total original) finalmente se eliminará después del pico de albúmina. Se puede evitar que esto ingrese al producto final deteniendo la recolección antes de que esto suceda.
- El 90% restante de la endotoxina unida (88,2% del total original) debe limpiarse de la columna con NaOH.
- Una alternativa al intercambio aniónico es la cromatografía de intercambio catiónico , en la que los solutos cargados positivamente se unen al medio cromatográfico sólido. En este método, el objetivo se une a la columna en lugar de a la endotoxina. La endotoxina luego se lava a través de la columna y luego se eluye una diana pura de la columna. Se ha demostrado que la cromatografía de intercambio catiónico purifica eficazmente el interferón β. (Dembinski, et al.) [7]
- Ultrafiltración
- Debido a que el peso molecular de las endotoxinas suele ser superior a 10 kD, la ultrafiltración a veces se puede utilizar para realizar una separación basada en el tamaño. Debido a la alta variabilidad del tamaño de las endotoxinas, puede ser difícil seleccionar la membrana correcta, por lo que este método se usa mejor solo cuando todas las endotoxinas presentes son mayores de 300.000 Da. Se ha demostrado que los ultrafiltros disponibles comercialmente eliminan los pirógenos a un nivel por debajo de 0,001 UE / ml. [ cita requerida ]
- Destilación
- Este método también se basa en el gran peso molecular y la estabilidad térmica de las endotoxinas. Los disolventes de bajo peso molecular se pueden purificar fácilmente hirviendo y recogiendo el vapor condensado en un recipiente libre de endotoxinas (ver "calentamiento" a continuación). Las grandes moléculas de LPS no se vaporizan fácilmente y, por lo tanto, quedan en el recipiente de calentamiento. Este es el método de elección para la purificación de agua.
Inactivación / destrucción
Debido a que los pirógenos a menudo son difíciles de eliminar, a veces puede ser preferible la inactivación o destrucción de la molécula de LPS.
- Hidrólisis ácido-base
- Se ha demostrado que este método escinde el lípido A del polisacárido en la molécula de LPS (ver a la derecha). El resto de lípidos por sí solo no es soluble en agua. Por tanto, incapaz de unirse a las células endoteliales , se vuelve inactivo. Sin embargo, la hidrólisis ácido-base puede desnaturalizar una proteína diana y, por lo tanto, no es adecuada para purificar una proteína.
- Oxidación
- La oxidación con peróxido de hidrógeno se usa a menudo como una solución destructora de pirógenos de bajo costo. Se desconoce el mecanismo de esta destrucción, pero el peróxido de hidrógeno se puede eliminar fácilmente más adelante en el proceso de purificación y, por lo tanto, es un método útil de eliminación de pirógenos. Sin embargo, al igual que la hidrólisis ácido-base, no es adecuada para purificar proteínas.
- Calefacción
- Los métodos de calentamiento se utilizan a menudo para garantizar que el vidrio y otros equipos de laboratorio estén libres de material pirogénico. El calor se aplica horneando en un horno de calor seco diseñado específicamente para el proceso de despirogenación. Aunque las endotoxinas son relativamente estables térmicamente, un calentamiento suficiente (250 ° C durante 30 min) da como resultado una reducción de 3 log de los niveles de endotoxinas. Debido a los altos niveles de temperatura, este método tampoco es adecuado para purificar proteínas.
- Hidróxido de sodio
- Al purificar proteínas, el hidróxido de sodio (NaOH) se puede utilizar de forma segura y eficaz. También se utiliza ampliamente para la despirogenación de equipos no esterilizables en autoclave (por ejemplo, plásticos) y columnas de cromatografía. De hecho, cuando se utiliza un intercambiador de aniones para eliminar pirógenos, es necesario limpiar la columna con NaOH después de cada lote.
Métodos preventivos
Debido a que prácticamente todas las materias primas involucradas en un proceso de producción, incluidos los empleados de la fábrica, pueden ser fuentes potenciales de contaminación por pirógenos, el cribado de materias primas y la despirogenación a menudo pueden contribuir en gran medida a garantizar que el producto final esté libre de pirógenos y no requiera una eliminación o eliminación costosa. métodos de inactivación. La ultrafiltración de productos químicos y soluciones tampón, la aplicación de prácticas higiénicas adecuadas y la realización de pruebas periódicas pueden resultar útiles.
Ver también
Referencias
- ^ Greer, Spencer; Salud, Escuela Pública JH Bloomberg. "Frederik Bang" . Escuela de Salud Pública Johns Hopkins Bloomberg .
- ^ [Sandle, T. (2013). Impurezas de productos farmacéuticos: considerando los beta glucanos, American Pharmaceutical Review, Suplemento 16 (5) S1: 16-19]
- ^ Maloney, Tom; Phelan, Ryan; Simmons, Naira (12 de octubre de 2018). "Salvar al cangrejo herradura: una alternativa sintética a la sangre de cangrejo herradura para la detección de endotoxinas" . PLOS Biología . 16 (10): e2006607. doi : 10.1371 / journal.pbio.2006607 .
- ^ Guía para las pruebas de pirógenos y endotoxinas de la industria: preguntas y respuestas , FDA, junio de 2012
- ^ Sandle, Tim (octubre de 2011). "Un enfoque práctico para los estudios de despirogenación con endotoxina bacteriana" . Revista de cumplimiento de GXP . 15 (4).
- ^ Eliminación cromatográfica de endotoxinas y / o etanol de albúmina. Nota de aplicación 206. Pharmacia Biotech., Uppsala, 1990.
- ^ Dembinski, W .; O'Malley, JA; Sulkowski, E. Procedimiento de purificación a gran escala para interferón de fibroblasto humano. Interferon Scientific Memoranda , enero / febrero, 6 (1983).
- Actualización LAL
- Actualización de LAL de despirogenación
- Sofer, G .; Hagel, L. (1997). Manual de cromatografía de procesos: una guía para la optimización, ampliación y validación. Prensa académica, 158-161. ISBN 0-12-654266-X
- Oficina de Asuntos Regulatorios de la FDA: Guía técnica de inspección, endotoxinas / pirógenos bacterianos
- Libro de texto de bacteriología
- Usos médicos del cangrejo herradura
- Tours, N. y Sandle, T. Comparación de despirogenación por calor seco utilizando tres tipos diferentes de endotoxinas bacterianas gramnegativas, European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, Volumen 13, No.1, 2008, pp17-20
- Un enfoque práctico para los estudios de despirogenación con endotoxina bacteriana [1]