La caracterización de las bicapas lipídicas es el uso de varios métodos de sondeo ópticos, químicos y físicos para estudiar las propiedades de las bicapas lipídicas. Muchas de estas técnicas son elaboradas y requieren un equipo costoso porque la naturaleza fundamental de la bicapa lipídica hace que sea una estructura muy difícil de estudiar. Una bicapa individual, dado que solo tiene unos pocos nanómetros de grosor, es invisible en la microscopía óptica tradicional. La bicapa es también una estructura relativamente frágil ya que se mantiene unido enteramente por no covalentese une y se destruye irreversiblemente si se retira del agua. A pesar de estas limitaciones, se han desarrollado decenas de técnicas durante los últimos setenta años para permitir las investigaciones de la estructura y función de las bicapas. El primer enfoque general fue utilizar mediciones in situ no destructivas , como la difracción de rayos X y la resistencia eléctrica, que midieron las propiedades de las bicapas pero en realidad no obtuvieron imágenes de la bicapa. Posteriormente, se desarrollaron protocolos para modificar la bicapa y permitir su visualización directa al principio en el microscopio electrónico y, más recientemente, con el microscopio de fluorescencia . Durante las últimas dos décadas, una nueva generación de herramientas de caracterización que incluye AFMha permitido el sondeo directo y la obtención de imágenes de membranas in situ con poca o ninguna modificación química o física. Más recientemente, se ha utilizado la interferometría de polarización dual para medir la birrefringencia óptica de las bicapas lipídicas para caracterizar el orden y la alteración asociados con interacciones o efectos ambientales.
Microscopio fluorescente
La microscopía de fluorescencia es una técnica mediante la cual ciertas moléculas pueden excitarse con una longitud de onda de luz y emitirán otra longitud de onda de luz más larga. Debido a que cada molécula fluorescente tiene un espectro único de absorción y emisión , se puede determinar la ubicación de tipos particulares de moléculas. Los lípidos naturales no emiten fluorescencia, por lo que siempre es necesario incluir una molécula de colorante para estudiar las bicapas lipídicas con microscopía de fluorescencia. Hasta cierto punto, la adición de la molécula de tinte siempre cambia el sistema y, en algunos casos, puede ser difícil decir si el efecto observado se debe a los lípidos, al tinte o, más comúnmente, a alguna combinación de los dos. El tinte generalmente está unido a un lípido o una molécula que se parece mucho a un lípido, pero dado que el dominio del tinte es relativamente grande, puede alterar el comportamiento de esta otra molécula. Este es un tema particularmente polémico cuando se estudia la difusión o separación de fases de los lípidos, ya que ambos procesos son muy sensibles al tamaño y la forma de las moléculas involucradas.
A esta complicación potencial se le ha dado un argumento en contra del uso de uno de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para determinar los coeficientes de difusión bicapa. En un experimento típico de FRAP, un área pequeña (~ 30 µm de diámetro) se fotoblanquea mediante la exposición a una fuente de luz intensa. Luego, esta área se monitorea a lo largo del tiempo a medida que las moléculas de tinte "muertas" se difunden y son reemplazadas por moléculas de tinte intactas de la bicapa circundante. Ajustando esta curva de recuperación es posible calcular el coeficiente de difusión de la bicapa. [1] [2] Un argumento en contra del uso de esta técnica es que lo que realmente se está estudiando es la difusión del tinte, no el lípido. [3] Si bien es correcta, esta distinción no siempre es importante, ya que la movilidad del tinte suele estar dominada por la movilidad de la bicapa.
En la microscopía de fluorescencia tradicional, la resolución se ha limitado a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada. Mediante el uso de microscopía confocal y procesamiento de imágenes, este límite puede extenderse, pero normalmente no muy por debajo de los 100 nanómetros, que es mucho más pequeño que una célula típica pero mucho más grande que el grosor de una bicapa lipídica. Más recientemente, los métodos de microscopía avanzados han permitido una resolución mucho mayor en determinadas circunstancias, incluso hasta subnm. Uno de los primeros de estos métodos que se desarrolló fue la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). En FRET, se eligen dos moléculas de colorante de modo que el espectro de emisión de una se superponga al espectro de absorción de la otra. Esta transferencia de energía depende en gran medida de la distancia, por lo que es posible saber con una resolución angstrom la distancia entre los dos tintes. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para determinar cuándo se fusionan dos bicapas y se mezclan sus componentes. [4] Otra técnica de microscopía de alta resolución es la microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC). Este método requiere que la muestra se monte sobre una superficie reflectante micromecanizada con precisión. Al estudiar los patrones de interferencia destructiva formados, es posible resolver individualmente las dos valvas de una bicapa soportada y determinar la distribución de un tinte fluorescente en cada una. [5]
Eléctrico
Las mediciones eléctricas son la forma más sencilla de caracterizar una de las funciones más importantes de una bicapa, a saber, su capacidad para segregar y prevenir el flujo de iones en solución. En consecuencia, la caracterización eléctrica fue una de las primeras herramientas utilizadas para estudiar las propiedades de sistemas modelo como las membranas negras. Ya se sabía que la membrana celular era capaz de soportar un gradiente iónico y que este gradiente es responsable de la capacidad de las neuronas para enviar señales a través de un potencial de acción . Demostrar que fenómenos similares se pueden reproducir in vitro fue una verificación importante de la utilidad de los sistemas modelo. [6]
Básicamente, todas las mediciones eléctricas de las bicapas implican la colocación de un electrodo a cada lado de la membrana. Aplicando una polarización a través de estos electrodos y midiendo la corriente resultante, es posible determinar la resistencia de la bicapa. Esta resistencia suele ser bastante alta para las bicapas intactas, a menudo superando los 100 GΩ, ya que el núcleo hidrófobo es impermeable a las especies hidratadas cargadas. Debido a que esta resistencia es tan grande, la presencia de incluso unos pocos agujeros a escala nanométrica da como resultado un aumento dramático de la corriente y se puede determinar fácilmente. [7] La sensibilidad de este sistema es tal que incluso la actividad de canales iónicos individuales puede resolverse. [8] En tales mediciones de CC, es necesario utilizar electrodos electroquímicamente activos para proporcionar las cargas positivas necesarias en un lado y cargas negativas en el otro. El sistema más común es el electrodo de plata / cloruro de plata ya que esta reacción es estable, reversible, implica una sola transferencia de electrones y puede producir grandes corrientes. [9] Además de las simples mediciones de corriente CC, también es posible realizar una caracterización eléctrica de CA para extraer información sobre la capacitancia y la impedancia compleja de una bicapa. Debido a que la capacitancia es inversamente proporcional al espesor y las bicapas son muy delgadas, por lo general tienen una capacitancia muy grande, del orden de 2 µF / cm 2 . Las mediciones de capacitancia son particularmente útiles cuando se trata de membranas de lípidos negros, ya que pueden usarse para determinar cuándo el tapón de disolvente / lípido se reduce a una sola bicapa.
Óptico
Los lípidos son moléculas altamente polares que cuando se autoensamblan en bicapas crean una capa altamente birrefringente [10] donde las propiedades ópticas paralelas son muy diferentes de las perpendiculares. Este efecto, estudiado por interferometría de polarización dual, se ha utilizado para medir la reorganización dinámica de la capa debido a la temperatura, la fuerza iónica y las interacciones moleculares con, por ejemplo, péptidos antimicrobianos.
Las bicapas hidratadas muestran una rica dinámica vibratoria y son buenos medios para una transferencia de energía vibratoria eficiente. Las propiedades vibratorias de las monocapas y bicapas de lípidos se han investigado mediante técnicas espectroscópicas ultrarrápidas [11] y métodos computacionales desarrollados recientemente. [12]
AFM
La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha utilizado en los últimos años para obtener imágenes y sondear las propiedades físicas de las bicapas lipídicas. AFM es una técnica prometedora porque tiene el potencial de obtener imágenes con resolución nanométrica a temperatura ambiente e incluso bajo el agua, condiciones necesarias para el comportamiento natural de las bicapas. Estas capacidades han permitido obtener imágenes directas de la transición sutil de la fase de ondulación en una bicapa compatible. [13] Otro experimento de AFM realizado en modo de tapping bajo medio tampón acuoso permitió (1) determinar la formación de poros transmembrana (agujeros) alrededor de nanopartículas de aproximadamente 1.2 a 22 nm de diámetro mediante la sustracción de imágenes de AFM de series registradas durante la bicapa lipídica formación y (2) para observar la adsorción de moléculas de insulina individuales en nanopartículas expuestas. [14] Otra ventaja es que AFM no requiere marcado fluorescente o isotópico de los lípidos, ya que la punta de la sonda interactúa mecánicamente con la superficie de la bicapa. Debido a esto, la misma exploración puede revelar información sobre la bicapa y cualquier estructura asociada, incluso hasta el punto de resolver proteínas de membrana individuales. [15] Además de las imágenes, AFM también puede sondear la naturaleza mecánica de pequeñas estructuras delicadas como las bicapas lipídicas. Un estudio demostró la posibilidad de medir el módulo elástico de membranas a nanoescala individuales suspendidas sobre alúmina anódica porosa. [dieciséis]
Aunque AFM es una herramienta poderosa y versátil para estudiar las bicapas lipídicas, existen algunas limitaciones y dificultades prácticas. Debido a la naturaleza frágil de la bicapa, se deben usar fuerzas de escaneo extremadamente bajas (típicamente 50pN o menos [13] [17] ) para evitar daños. Esta consideración es particularmente importante cuando se estudian sistemas metaestables como vesículas adsorbidas en un sustrato, ya que la punta de AFM puede inducir rotura y otros cambios estructurales. [18] También se debe tener cuidado de elegir un material y una preparación de superficie apropiados para la punta de AFM, ya que las superficies hidrófobas pueden interactuar fuertemente con los lípidos y alterar la estructura de la bicapa. [19]
Microscopio de electrones
En microscopía electrónica, un haz de electrones enfocados interactúa con la muestra en lugar de un haz de luz como en la microscopía tradicional. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que la luz, por lo que la microscopía electrónica tiene una resolución mucho más alta que la microscopía óptica, potencialmente hasta la escala atómica. Debido a que las bicapas lipídicas están dispuestas a nivel molecular, esta resolución más alta ha sido invaluable. En 1960, cuando aún se debatía la estructura de la bicapa, fue la microscopía electrónica la que ofreció la primera visualización directa de los dos folletos opuestos. [20] Junto con las técnicas de congelación rápida, la microscopía electrónica también se ha utilizado para estudiar los mecanismos de transporte inter e intracelular, por ejemplo, para demostrar que las vesículas exocitóticas son el medio de liberación química en las sinapsis . [21] A menudo, la microscopía electrónica es la única técnica de sonda con resolución suficiente para determinar morfologías complejas a escala nanométrica.
Las limitaciones de la microscopía electrónica en el estudio de las estructuras lipídicas se refieren principalmente a la preparación de muestras. La mayoría de los microscopios electrónicos requieren que la muestra esté al vacío, lo que es incompatible con la hidratación a temperatura ambiente. Para superar este problema, se pueden obtener imágenes de las muestras en condiciones criogénicas con el agua asociada congelada, o se puede obtener un negativo metálico a partir de una muestra congelada. También es típicamente necesario teñir la bicapa con un compuesto de metal pesado como tetróxido de osmio o acetato de uranilo porque los constituyentes de lípidos de bajo peso atómico (carbono, nitrógeno, fósforo, etc.) ofrecen poco contraste en comparación con el agua. Si se utiliza un microscopio electrónico de transmisión (TEM), también es necesario cortar o pulir la muestra en una hoja muy delgada (<1 micrómetro), lo que puede resultar difícil y llevar mucho tiempo. La microscopía electrónica de barrido (SEM) no requiere este paso, pero no puede ofrecer la misma resolución que TEM. Ambos métodos son técnicas sensibles a la superficie y no pueden revelar información sobre estructuras profundamente enterradas.
Dispersión de neutrones y rayos X
Tanto los rayos X como los neutrones de alta energía se utilizan para sondear la estructura y la periodicidad de las estructuras biológicas, incluidas las bicapas, porque pueden sintonizarse para interactuar con la materia en las escalas de longitud relevantes (angstrom-nm). A menudo, estas dos clases de experimentos proporcionan información complementaria porque cada una tiene diferentes ventajas y desventajas. Los rayos X interactúan solo débilmente con el agua, por lo que las muestras a granel se pueden sondear con una preparación de muestras relativamente fácil. Esta es una de las razones por las que la dispersión de rayos X fue la técnica que se utilizó por primera vez para estudiar sistemáticamente el espaciamiento entre capas. [22] La dispersión de rayos X también puede proporcionar información sobre el espaciamiento promedio entre moléculas de lípidos individuales , lo que ha llevado a su uso para caracterizar las transiciones de fase . [23] Una limitación de las técnicas de rayos X es que los rayos X son relativamente insensibles a elementos ligeros como el hidrógeno. Este efecto es una consecuencia del hecho de que los rayos X interactúan con la materia mediante la dispersión de la densidad de electrones, que disminuye al disminuir el número atómico. Por el contrario, los neutrones se dispersan por la densidad nuclear y los campos magnéticos nucleares, por lo que la sensibilidad no disminuye monótonamente con z . Este mecanismo también proporciona un fuerte contraste isotópico en algunos casos, especialmente entre el hidrógeno y el deuterio , lo que permite a los investigadores ajustar la línea de base experimental mezclando agua y agua deuterada. El uso de la reflectometría en lugar de la dispersión con neutrones o rayos X permite a los experimentadores sondear bicapas o pilas multicapa soportadas. Estas mediciones son más complicadas de realizar un análisis, pero permiten la determinación de la composición de la sección transversal, incluida la ubicación y concentración de agua dentro de la bicapa. [24] En el caso de las mediciones de dispersión de rayos X y de neutrones, la información proporcionada es un promedio del conjunto del sistema y, por lo tanto, está sujeta a incertidumbre basada en las fluctuaciones térmicas en estas estructuras altamente móviles. [25]
Referencias
- ^ D. Axelrod, DE Koppel, J. Schlessinger, E. Elson y WW Webb. "Medición de la movilidad mediante el análisis de la cinética de recuperación del fotoblanqueo de fluorescencia". Revista biofísica . 16. (1976) 1055-69.
- ^ DM Soumpasis. "Análisis teórico de experimentos de recuperación de fotoblanqueo por fluorescencia". Revista biofísica. 41. (1983) 95-7.
- ^ WL Vaz y PF Almeida. "Difusión microscópica versus macroscópica en membranas de bicapa lipídica en fase líquida de un componente". Revista biofísica. 60. (1991) 1553-1554.
- ^ L. Guohua y RC Macdonald. "Fusión de vesículas de bicapa lipídica: intermedios capturados por espectroscopia de microfluorescencia de alta velocidad". Revista biofísica. 85. (2003) 1585-1599.
- ^ JM Crane, V. Kiessling y LK Tamm. "Medición de la asimetría de lípidos en bicapas con soporte plano mediante microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia". Langmuir. 21. (2005) 1377-1388.
- ^ P. Mueller, DO Rudin, HI Tien y WC Wescott. "Reconstitución de la estructura de la membrana celular in vitro y su transformación en un sistema excitable". Naturaleza. 194. (1962) 979-980.
- ^ KC Melikov, VA Frolov, A. Shcherbakov, AV Samsonov, YA Chizmadzhev y LV Chernomordik. "Preporos no conductores inducidos por voltaje y poros individuales metaestables en bicapa lipídica plana no modificada" Diario biofísico. 80. (2001) 1829-1836.
- ^ E. Neher y B. Sakmann. "Corrientes monocanal registradas desde la membrana de fibras musculares de rana denervadas" Nature. 286. (1976) 71-73.
- ^ DT Sawyer, "Electroquímica para químicos". 2ª Ed. 1995: Wiley Interscience.
- ^ Alireza Mashaghi y col. Anisotropía óptica de estructuras lipídicas soportadas probadas por espectroscopia de guía de ondas y su aplicación al estudio de la cinética de formación de bicapas lipídicas soportadas Anal. Chem., 80 (10), 3666–3676 (2008)
- ^ M. Bonn et al., Inhomogeneidad estructural del agua interfacial en monocapas lipídicas revelada por espectroscopía de sonda de bomba vibratoria específica de superficie, J. Am. Chem. Soc. 132, 14971–14978 (2010).
- ^ Mischa Bonn et al., Interfacial Water Facilitates Energy Transfer by Inducing Extended Vibrations in Membrane Lipids, J Phys Chem, 2012 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp302478a
- ^ a b T. Kaasgaard, C. Leidy, JH Crowe, OE Mouritsen y K. Jorgensen. "Estructura controlada por temperatura y cinética de las fases de ondulación en bicapas lipídicas compatibles con uno y dos componentes" Diario biofísico. 85. (2003) 350-360.
- ^ Y. Roiter, M. Ornatska, AR Rammohan, J. Balakrishnan, DR Heine y S. Minko, Interacción de nanopartículas con membrana lipídica , Nano Letters, vol. 8, edición. 3, págs. 941-944 (2008).
- ^ RP Richter y A. Brisson. "Caracterización de bicapas lipídicas y ensamblajes proteicos soportados sobre superficies rugosas mediante microscopía de fuerza atómica". Langmuir. 19. (2003) 1632-1640.
- ^ S. Steltenkamp, MM Muller, M. Deserno, C. Hennesthal, C. Steinem y A. Janshoff. "Propiedades mecánicas de las bicapas lipídicas que abarcan los poros comprobadas por microscopía de fuerza atómica". Revista biofísica. 91. (2006) 217-226.
- ^ SW Hui, R. Viswanathan, JA Zasadzinski y JN Israelachvili. "La estructura y estabilidad de las bicapas de fosfolípidos por microscopía de fuerza atómica". Revista biofísica. 68. (1995) 171-8.
- ^ K. Dimitrievski, M. Zach, VP Zhadanov y B. Kasemo. "Imágenes y manipulación de vesículas lipídicas adsorbidas por una punta AFM: Experimento y simulaciones de Monte Carlo". Coloides y superficies B 47. (2006) 115-125.
- ^ J. Schneider, W. Barger y GU Lee. "Propiedades superficiales a escala nanométrica de bicapas lipídicas soportadas medidas con sondas de microscopio de fuerza atómica hidrofóbicas e hidrofílicas". Langmuir. 19. (2003) 1899-1907.
- ^ JD Robertson. "La estructura molecular y las relaciones de contacto de las membranas celulares". Progreso en Biofísica y Química Biofísica. 10. (1960) 343-418.
- ^ JE Heuser, TS Reese, MJ Dennis, Y. Jan, L. Jan y L. Evans. "Exocitosis de vesículas sinápticas capturada por congelación rápida y correlacionada con la liberación del transmisor cuántico". Revista de biología celular. 81. (1979) 275-300.
- ^ D. Papahadjapoulos y N. Miller. "Membranas modelo de fosfolípidos I. Características estructurales de los cristales líquidos hidratados". Biochimica et Biophysica Acta. 135. (1967) 624-638.
- ^ DM Small. "Equilibrios de fase y estructura de lecitina de huevo seca e hidratada" Journal of Lipid Research. 8. (1967) 551-557.
- ^ G. Zaccai, JK Blasie y BP Schoenborn. "Estudios de difracción de neutrones sobre la ubicación del agua en membranas modelo de lecitina bicapa". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 72. (1975) 376-380.
- ^ D. Boal, "Mecánica de la célula". 2002, Cambridge, Reino Unido: Cambridge University Press.