Los ciclos de amplificación basados en bucles y recocido múltiple ( MALBAC ) es un método de amplificación del genoma completo cuasilineal . A diferencia de los métodos de amplificación de ADN convencionales que no son lineales o exponenciales (en cada ciclo, el ADN copiado puede servir como plantilla para los ciclos posteriores), MALBAC utiliza cebadores especiales que permiten que los amplicones tengan extremos complementarios y, por lo tanto , formen un bucle, evitando que el ADN se copie exponencialmente. . Esto da como resultado la amplificación de solo el ADN genómico original y, por lo tanto, reduce el sesgo de amplificación. MALBAC se "utiliza para crear amplicones de escopeta superpuestos que cubren la mayor parte del genoma". [1] Para la secuenciación de próxima generación, MALBAC es seguido por PCR regular que se utiliza para amplificar aún más los amplicones.
Plataforma tecnológica
Antes de MALBAC, una sola célula se aísla mediante varios métodos, incluida la microdisección por captura con láser , dispositivos de microfluidos , citometría de flujo o micropipeteo, y luego se lisan. La amplificación del genoma completo de una sola célula de MALBAC implica 5 ciclos de extinción, extensión, fusión y bucle.
Imprimaciones MALBAC
La principal ventaja de MALBAC es que el ADN se amplifica casi de forma lineal. La utilización de cebadores especializados permite la formación de bucles de amplicones, lo que evita que se amplifiquen más en los ciclos posteriores de MALBAC. Estos cebadores tienen 35 nucleótidos de longitud, con 8 nucleótidos variables que hibridan con las plantillas y 27 nucleótidos comunes. [1] La secuencia de nucleótidos común es GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG. Los 8 nucleótidos variables se aparean aleatoriamente con la molécula de ADN genómico monocatenario. Después de una extensión, se elabora un semi-amplicón, un amplicón que contiene la secuencia de nucleótidos común sólo en el extremo 5 '. Este semi-amplicón se usa como plantilla para otra ronda de extensión, que luego da como resultado un amplicón completo, un amplicón donde el extremo 3 'es complementario a la secuencia en el extremo 5'.
Desplazamiento de hebra
Los cebadores MALBAC tienen componentes variables que les permiten unirse aleatoriamente al ADN molde. Esto significa que en un solo fragmento en cualquier ciclo, podría haber múltiples cebadores apareados al fragmento. Una ADN polimerasa como una derivada de Bacillus stearothermophilus ( Bst polimerasa) es capaz de desplazar el extremo 5 'de otra hebra corriente arriba que crece en la misma dirección. [2]
Tasa de error
La ADN polimerasa Bst tiene una tasa de error de 1/10000 bases. [3]
Flujo de trabajo experimental
- Aislamiento y lisis de una sola célula: se utilizan como plantillas pg de fragmentos de ADN genómico (10 a 100 kb) aislados de una sola célula.
- Fusión : a 94 ° C, las moléculas de ADN bicatenario se funden en formas monocatenarias.
- Apagado : después de la fusión, la reacción se apaga inmediatamente a 0 ° C y se añaden cebadores MALBAC a la reacción.
- Extensión : la ADN polimerasa Bst (fragmento grande) extiende los cebadores a 65 ° C durante 2 minutos, creando semi-amplicones.
- Fusión : la reacción se calienta a 94 ° C para separar el semi-amplicón de la plantilla de ADN genómico.
- Apagado : la reacción se apaga rápidamente a 0 ° C y, a continuación, se agrega la misma mezcla de polimerasa. Los cebadores MALBAC se unen eficazmente tanto a los semi-amplicones como a la plantilla de ADN genómico.
- Extensión : la ADN polimerasa Bst (fragmento grande) extiende los cebadores a 65 ° C durante 2 minutos. En este paso, se hacen amplicones completos para aquellos que usaron semi-amplicones como plantillas, y también se hacen semi-amplicones para aquellos que usaron la plantilla de ADN genómico como plantillas.
- Fusión : la reacción se calienta a 94 ° C para separar los amplicones de la plantilla.
- Bucle : para amplicones completos, la secuencia del extremo 3 'ahora es complementaria al extremo 5'. A 58 ° C, los dos extremos se hibridan formando un ADN en bucle. Esto evita que el amplicón completo se utilice como plantilla en los ciclos posteriores de MALBAC.
- Repita los pasos 6 a 9 cinco veces - 5 ciclos de amplificación lineal MALBAC.
- PCR regular : el producto MALBAC se amplifica aún más mediante PCR. Al usar los 27 nucleótidos comunes como cebadores, solo se amplifican los amplicones completos.
Al final de la PCR, los picogramos de material genético se amplifican a microgramos de ADN, lo que produce suficiente ADN para secuenciar.
Aplicaciones
MALBAC ofrece un enfoque imparcial para la amplificación del ADN de una sola célula. Este método de secuenciación unicelular tiene una gran cantidad de aplicaciones, muchas de las cuales aún no se han explotado. MALBAC puede ayudar en el análisis de muestras forenses, en la detección prenatal de enfermedades genéticas, en la comprensión del desarrollo de las células reproductivas o en el esclarecimiento de la complejidad de un tumor. [1] [4] En su base, esta tecnología permite a los investigadores observar la frecuencia con la que las mutaciones se acumulan en células individuales. [1] Además, permite la detección de anomalías cromosómicas y variaciones en el número de copias de genes (CNV) dentro y entre las células, y facilita aún más la detección de mutaciones poco comunes que dan como resultado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [1]
En el campo de la investigación del cáncer , MALBAC tiene muchas aplicaciones. Puede usarse para examinar la heterogeneidad intratumoral, para identificar genes que pueden conferir un fenotipo agresivo o metastásico, o para evaluar la posibilidad de que un tumor desarrolle resistencia a fármacos . [4] [5] Una aplicación pionera de MALBAC se publicó en una edición de Science de diciembre de 2012 y describió el uso de esta tecnología para medir la tasa de mutación de la línea celular de cáncer de colon SW4802. [1] Al secuenciar el ADN amplificado de tres células de cáncer de colon afines en paralelo con células de cáncer de colon no relacionadas de un linaje diferente, se identificaron SNP sin que se detectaran falsos positivos. [1] También se observó que las transversiones purina-pirimidina ocurrieron con una frecuencia alta entre los SNP. [1] La caracterización del número de copias y las variaciones de un solo nucleótido de las células de cáncer de colon único destacó la heterogeneidad presente dentro de un tumor. [1]
MALBAC se ha aplicado como método para examinar la diversidad genética entre las células reproductoras. Al secuenciar los genomas de 99 espermatozoides humanos individuales de un donante anónimo, se utilizó MALBAC para examinar los eventos de recombinación genética que involucran gametos individuales y, en última instancia, proporcionar información sobre la dinámica de la recombinación genética y su contribución a la infertilidad masculina. [6] Además, dentro de un espermatozoide individual, MALBAC identificó cromosomas duplicados o faltantes, así como SNP o CNV que podrían afectar negativamente la fertilidad. [6]
Ventajas
MALBAC ha dado lugar a muchos avances significativos sobre otras técnicas de secuenciación de una sola célula, sobre todo que puede informar el 93% del genoma de una sola célula humana. [1] Algunas de las ventajas de esta tecnología incluyen un sesgo de amplificación reducido y una mayor cobertura del genoma , el requisito de muy poca plantilla de ADN y bajas tasas de mutaciones falsas positivas y falsas negativas. [4] [6]
Reduce el sesgo de amplificación y aumenta la cobertura del genoma
MALBAC es una forma de secuenciación del genoma completo que reduce el sesgo asociado con la amplificación por PCR exponencial mediante el uso de una fase cuasilineal de preamplificación. [1] MALBAC utiliza cinco ciclos de preamplificación y cebadores que contienen una secuencia común de 27 nucleótidos y una secuencia variable de 8 nucleótidos para producir fragmentos de ADN amplificado (amplicones) que se repiten sobre sí mismos para evitar copias adicionales e hibridación cruzada. [1] [7] Estos bucles no se pueden utilizar como plantilla para la amplificación durante MALBAC y, por lo tanto, reducen el sesgo de amplificación comúnmente asociado con la amplificación exponencial desigual de los fragmentos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa. [1] Se ha descrito que MALBAC tiene una mejor uniformidad de amplificación que otros métodos de secuenciación única, como la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA). [1] [5] La MDA no utiliza bucles de ADN y amplifica el ADN de manera exponencial, lo que genera un sesgo. [1] En consecuencia, el sesgo de amplificación asociado con otros métodos de secuenciación unicelular da como resultado una baja cobertura del genoma. [1] [5] El sesgo reducido asociado con MALBAC ha generado una mejor cobertura de la secuencia del genoma que otros métodos de secuenciación de células individuales.
Requiere muy poca plantilla de ADN
MALBAC se puede utilizar para amplificar y posteriormente secuenciar el ADN cuando solo se dispone de una o unas pocas células, como en el análisis de células tumorales circulantes, cribados prenatales o muestras forenses. [4] [7] Solo se requiere una pequeña cantidad de plantilla inicial (picogramos de ADN) para iniciar el proceso y, por lo tanto, es un método ideal para la secuenciación de una sola célula humana. [1]
Baja incidencia de mutaciones falsas positivas y falsas negativas
La secuenciación unicelular a menudo tiene una alta tasa de mutaciones falsas negativas. [1] Una tasa de mutación de falsos negativos se define como la probabilidad de no detectar una mutación real, y esto puede ocurrir debido al sesgo de amplificación resultante de la pérdida o abandono de un alelo. [8] La uniformidad de la cobertura de secuencia de MALBAC en comparación con otras técnicas de secuenciación de una sola célula ha mejorado la detección de SNP y reducido la tasa de abandono de alelos . [1] La tasa de abandono alélico aumenta cuando un alelo de un heterocigoto no se amplifica, lo que da como resultado la identificación de un "homocigoto falso". Esto puede ocurrir debido a la baja concentración de la plantilla de ADN o la amplificación desigual de la plantilla, lo que da como resultado que un alelo de un heterocigoto se copie más que el otro. [8] Se ha demostrado que la tasa de abandono del alelo de MALBAC es mucho menor (aproximadamente 1%) en comparación con MDA, que es aproximadamente 65%. En contraste con MDA, que se ha demostrado que tiene una eficiencia de detección de SNP del 41% en comparación con la secuenciación masiva, se ha informado que MALBAC tiene una deficiencia de detección de SNP del 76%. [1] También se ha informado que MALBAC tiene una tasa baja de falsos positivos . Las mutaciones falsas positivas generadas por MALBAC son en gran parte el resultado de errores introducidos por la ADN polimerasa durante el primer ciclo de amplificación que se propagan durante los ciclos posteriores. Esta tasa de falsos positivos puede eliminarse secuenciando 2-3 células dentro de un linaje derivado de una sola célula para verificar la presencia de un SNP y eliminando los errores de secuenciación y amplificación secuenciando células no relacionadas de un linaje separado. [1]
Limitaciones
- Debido al requisito de una cantidad baja de ADN molde, la contaminación del ADN objetivo por parte del operador o del entorno puede confundir potencialmente los resultados de la secuenciación. [1]
- Para descartar por completo los falsos positivos, es necesario comparar los resultados de la secuenciación celular con los obtenidos de 2-3 células dentro del mismo linaje, así como con las células de un linaje no relacionado. [1]
- La ADN polimerasa utilizada para amplificar la plantilla de ADN es propensa a errores y puede introducir errores de secuenciación en el primer ciclo de MALBAC que se propagan posteriormente. [1] [4]
- La cobertura del genoma a nivel de una sola célula usando MALBAC es menos uniforme que la secuenciación masiva. Aunque MALBAC ha mejorado la eficiencia de detección de la secuenciación de células individuales, no puede detectar aproximadamente un tercio de los SNP en comparación con la secuenciación masiva. [1] [4]
enlaces externos
- [1] Base de datos NCBI
- [2] Yikon Genomics: Amplificación del genoma completo (WGA) y ciclos de amplificación basados en bucle y recocido múltiple (MALBAC)
Referencias
- ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y Zong, C .; Lu, S .; Chapman, AR; Xie, S. (2012). "Detección de todo el genoma de variaciones de un solo nucleótido y del número de copias de una sola célula humana". Science 338, 1622. DOI: 10.1126 / science.1229164. PMID 23258894
- ^ "Aviel-Ronen, S .; Qi Zhu, C .; Coe, BP; Liu, N .; Watson, SK; Lam, WL; Tsao, MS (2006)" ADN polimerasa de Bst de fragmento grande para la amplificación del ADN del genoma completo a partir de tejidos incluidos en parafina fijados con formalina. "BMC Genomics 7. DOI: 10.1186 / 1471-2164-7-312. PMID 17156491
- ^ PROTOCOLOS ACTUALES EN BIOLOGÍA MOLECULAR, Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. 1995. Pp 7.4.18.
- ↑ a b c d e f Baker, M. (2012). "El método ofrece un plano de una sola célula humana". Nature News. doi : 10.1038 / nature.2012.12088
- ^ a b c Lu, S .; Zong, C .; Ventilador, W .; Yang, M .; Li, J .; Chapman, AR; Zhu, P .; Hu, X .; Xu, L .; Yan, L .; Bai, F .; Qiao, J .; Tang, F .; Li, R .; Xie, S. (2012). "Exploración de la recombinación meiótica y la aneuploidía de espermatozoides individuales mediante secuenciación del genoma completo". Science 338, 1627. DOI: 10.1126 / science.1229112. PMID 23258895
- ↑ a b Reuell, P. (2013). "Una célula es todo lo que necesita: una técnica innovadora puede secuenciar el genoma completo de una sola célula". Harvard Gazette. http://news.harvard.edu/gazette/story/2013/01/one-cell-is-all-you-need/
- ^ a b Miller, CR; Joyce, P .; Espera, LP (2002). "Evaluación de la deserción alélica y la confiabilidad del genotipo utilizando la máxima probabilidad". Genética 160 (1) 357-366. PMID 11805071