La purificación de ácidos nucleicos basada en columna de centrifugación es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos . Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se unirá a la fase sólida de la sílice en determinadas condiciones.
Procedimiento
Las etapas del método son lisar, unir, lavar y eluir. [1] [2] Más específicamente, esto implica la lisis de las células diana para liberar ácidos nucleicos , unión selectiva de ácido nucleico a una membrana de sílice, lavado de partículas e inhibidores que no están unidos a la membrana de sílice y elución del ácido nucleico. ácido, con el resultado final siendo ácido nucleico purificado en una solución acuosa.
Para la lisis, las células (sangre, tejido, etc.) de la muestra deben someterse a un tratamiento para romper la membrana celular y liberar el ácido nucleico. Dependiendo del material de destino, esto puede incluir el uso de detergente u otros tampones, proteinasas u otras enzimas, calentamiento a varios tiempos / temperaturas, o interrupciones mecánicas como cortar con un cuchillo u homogeneizador , usar un mortero y un mortero, o una perla. batiendo con un molino de cuentas.
Para la unión, luego se agrega una solución tampón a la muestra lisada junto con etanol o isopropanol . La muestra en la solución de unión se transfiere luego a una columna de centrifugación y la columna se coloca en una centrífuga o se conecta al vacío. La centrífuga / vacío fuerza la solución a través de una membrana de sílice que se encuentra dentro de la columna de rotación, donde, en las condiciones iónicas adecuadas, los ácidos nucleicos se unirán a la membrana de sílice a medida que pasa el resto de la solución. Con el material de destino unido, se puede eliminar el flujo continuo.
Para lavar, se agrega un nuevo tampón a la columna, luego se centrifuga / aspira a través de la membrana. Este tampón está destinado a mantener las condiciones de unión, al tiempo que elimina las sales de unión y otros contaminantes restantes. Generalmente se necesitan varios lavados, a menudo con porcentajes crecientes de etanol / isopropanol, hasta que el ácido nucleico de la membrana de sílice esté libre de contaminantes. El último "lavado" es a menudo un paso en seco para permitir que el alcohol se evapore, dejando solo ácidos nucleicos purificados unidos a la columna.
Finalmente, la elución es el proceso de agregar una solución acuosa a la columna, permitiendo que el ácido nucleico hidrófilo abandone la columna y vuelva a la solución. Este paso se puede mejorar con sal, pH, tiempo o calor. Finalmente, para capturar el eluido / eluyente, la columna se transfiere a un microtubo limpio antes de un último paso de centrifugación.
Métodos relacionados
Incluso antes de los métodos de ácido nucleico empleados en la actualidad, se sabía que en presencia de agentes caotrópicos , como el yoduro de sodio o el perclorato de sodio , el ADN se une a sílice, partículas de vidrio o algas unicelulares llamadas diatomeas que protegen sus paredes celulares con sílice . Esta propiedad se usó para purificar ácido nucleico usando polvo de vidrio o perlas de sílice en condiciones alcalinas. [3] Esto se mejoró posteriormente utilizando tiocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio como agente caotrópico. [4] Para facilitar el manejo, el uso de perlas de vidrio se cambió posteriormente a columnas de sílice. Y para permitir el uso de instrumentos de extracción automatizados, se desarrollaron perlas paramagnéticas recubiertas de sílice , más comúnmente conocidas como extracción de "perlas magnéticas".
Ver también
Referencias
- ^ Matson, Robert S. (2008). Métodos y protocolos de microarrays . Boca Raton, Florida: CRC. págs. 27-29. ISBN 978-1420046656.
- ^ Kumar, Anil (2006). Ingeniería genética . Nueva York: Nova Science Publishers. págs. 101-102. ISBN 159454753X.
- ↑ Marko MA, Chipperfield R, Birnboim HC. Un procedimiento para el aislamiento a gran escala de ADN plasmídico altamente purificado mediante extracción alcalina y unión a polvo de vidrio. Anal Biochem. Abril de 1982; 121 (2): 382-7. PMID 6179438
- ^ Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Método rápido y sencillo para la purificación de ácidos nucleicos. J Clin Microbiol. Marzo de 1990; 28 (3): 495-503. PMID 1691208