El coeficiente síncrono de alteración de arrastre ( SCODA ) es un método biotecnológico para purificar, separar y / o concentrar biomoléculas. SCODA tiene la capacidad de separar moléculas cuya movilidad (o arrastre) se puede alterar en sincronía con un campo de conducción. Esta técnica se ha utilizado principalmente para concentrar y purificar ADN , donde la movilidad del ADN cambia con un campo electroforético aplicado . [1] [2] [3] También se ha demostrado SCODA electroforético con ARN y proteínas .
Teoría
Como se muestra a continuación, el principio SCODA se aplica a cualquier partícula impulsada por un campo de fuerza en el que la movilidad de la partícula se altera en sincronía con el campo impulsor.
Principio SCODA
Para fines explicativos, considere una partícula electroforética que se mueve (impulsa) en un campo eléctrico. Dejar:
- (1)
y
- (2)
denotar un campo eléctrico y la velocidad de la partícula en dicho campo. Si es constante el promedio de tiempo de .
Si no es constante en función del tiempo y si tiene un componente de frecuencia proporcional a el tiempo promedio de no necesita ser cero.
Considere el siguiente ejemplo:
- (3)
Sustituyendo (3) en (2) y calculando el promedio de tiempo, , obtenemos:
- (4)
Por lo tanto, es posible que la partícula experimente una velocidad promedio en el tiempo distinta de cero, en otras palabras, una deriva electroforética neta, incluso cuando el promedio en el tiempo del campo eléctrico aplicado es cero.
Creación de geometría de campo de enfoque
Considere una partícula bajo un campo de fuerza que tiene una velocidad paralela a la dirección del campo y una velocidad proporcional al cuadrado de la magnitud del campo eléctrico (se puede emplear cualquier otra no linealidad [1] ):
- (5)
La movilidad efectiva de la partícula (la relación entre pequeños cambios en la velocidad de deriva con respecto a pequeños cambios en el campo eléctrico ) se puede expresar en coordenadas cartesianas como:
- (6)
- (7)
Combinando (5), (6) y (7) obtenemos:
- (8)
- (9)
Considere además que el campo E se aplica en un plano y gira en sentido antihorario a una frecuencia angular , de manera que los componentes del campo son:
- (10)
- (11)
Sustituir (10) y (11) en (8) y (9) y simplificar usando identidades trigonométricas da como resultado una suma de términos constantes, seno y coseno, a frecuencia angular . Los siguientes cálculos se realizarán de manera que solo los términos del coseno a la frecuencia angular producirá una velocidad de deriva neta distinta de cero; por lo tanto, solo necesitamos evaluar estos términos, que se abreviarán y . Se obtiene lo siguiente:
- (12)
- (13)
Dejar y tomar la forma de un pequeño campo cuadripolar de intensidad que varía de manera sinusoidal proporcional a tal que:
- (14)
- (15)
Sustituyendo (14) y (15) en (12) y (13) y tomando el promedio de tiempo obtenemos:
- (dieciséis)
- (17)
que se puede resumir en notación vectorial para:
- (18)
La ecuación (18) muestra que para todas las posiciones la velocidad promedio en el tiempo está en la dirección hacia el origen (concentrando las partículas hacia el origen), con velocidad proporcional al coeficiente de movilidad k, la fuerza del campo rotatorio E y la fuerza del campo cuadripolar perturbador .
Concentración y purificación de ADN
Las moléculas de ADN son únicas porque son polímeros largos y cargados que cuando se encuentran en un medio de separación, como el gel de agarosa , pueden exhibir perfiles de velocidad altamente no lineales en respuesta a un campo eléctrico. Como tal, el ADN se separa fácilmente de otras moléculas que no están cargadas y son fuertemente no lineales, utilizando SCODA [2]
Inyección de ADN
Para realizar la concentración SCODA de moléculas de ADN, la muestra debe estar embebida en el medio de separación (gel) en lugares donde el campo electroforético sea de intensidad óptima. Esta translocación inicial de la muestra a la posición de concentración óptima se denomina "inyección". La posición óptima está determinada por la geometría del gel y la ubicación de los electrodos impulsores SCODA. Inicialmente, la muestra se ubica en una solución tampón en la cámara de muestras, adyacente al gel de concentración. La inyección se logra mediante la aplicación de un campo electroforético de CC controlado a través de la cámara de muestra, lo que da como resultado que todas las partículas cargadas se transfieran al gel de concentración. Para obtener un buen apilamiento de la muestra (es decir, una banda de ADN ajustada) se pueden emplear múltiples métodos. Un ejemplo es aprovechar la relación de conductividad entre el tampón de la cámara de muestra y el tampón de gel de concentración. Si el tampón de la cámara de muestra tiene una conductividad baja y el tampón de gel de concentración tiene una conductividad alta, esto da como resultado una caída brusca del campo eléctrico en la interfaz gel-tampón que promueve el apilamiento.
Concentración de ADN
Una vez que el ADN se coloca de manera óptima en el gel de concentración, se aplican los campos giratorios SCODA. La frecuencia de los campos se puede ajustar de modo que solo se concentren longitudes específicas de ADN. Para evitar la ebullición durante la etapa de concentración debido al calentamiento Joule, el medio de separación puede enfriarse activamente. También es posible invertir la fase de los campos SCODA, de modo que las moléculas estén desenfocadas.
Purificación de ADN
Como solo las partículas que exhiben una velocidad no lineal experimentan la fuerza de concentración de SCODA, las pequeñas partículas cargadas que responden linealmente a los campos electroforéticos no se concentran. Estas partículas en lugar de girar en espiral hacia el centro de la órbita del gel SCODA en un radio constante. Si se superpone un campo de CC débil en los campos giratorios de SCODA, estas partículas se "lavarán" del gel de SCODA, lo que dará como resultado un ADN de alta pureza que queda en el centro del gel.
Extracción de ADN
La fuerza del ADN de SCODA da como resultado que la muestra de ADN se concentre en el centro del gel de SCODA. Para extraer el ADN, se puede preformar un pozo de extracción en el gel y llenar con tampón. Como el ADN no experimenta movilidad no lineal en el tampón, se acumula en el pozo de extracción. Al final de la etapa de concentración y purificación, la muestra se puede extraer con pipeta de este pozo.
Aplicaciones
Purificación de ADN de alto peso molecular
La fuerza electroforética SCODA es lo suficientemente suave como para mantener la integridad del ADN de alto peso molecular, ya que se concentra hacia el centro del gel SCODA. Dependiendo de la longitud del ADN en la muestra, se pueden utilizar diferentes protocolos para concentrar ADN de más de 1 Mb de longitud.
Purificación de ADN contaminado
La concentración y purificación del ADN se ha logrado directamente a partir de muestras de arenas bituminosas resuspendidas en tampón mediante la técnica SCODA. Posteriormente se llevó a cabo la secuenciación del ADN y, de manera tentativa, se han identificado más de 200 genomas bacterianos distintos. [2] [4] SCODA también se ha utilizado para la purificación de ADN de muchas otras fuentes ambientales. [5] [6]
Específico de secuencia
La movilidad no lineal del ADN en gel puede controlarse aún más mediante la inclusión en los oligonucleótidos de ADN del gel SCODA complementarios a los fragmentos de ADN en la muestra. [7] [8] Esto da como resultado velocidades no lineales altamente específicas para el ADN de la muestra que coincide con el ADN incrustado en gel. Esta no linealidad artificial específica se usa luego para concentrar selectivamente solo las secuencias de interés mientras se rechazan todas las demás secuencias de ADN en la muestra. Se ha demostrado un enriquecimiento de más de 1.000.000 de veces de variantes de un solo nucleótido sobre el tipo salvaje.
Una aplicación de esta técnica es la detección de ADN derivado de tumores raros ( ADNc ) a partir de muestras de sangre. [9]
Ver también
Referencias
- ↑ a b Marziali, Andre; Pel, Joel; Bizzotto, Dan; Whitehead, Lorne A. (1 de enero de 2005). "Mecanismo de electroforesis novedoso basado en perturbaciones de arrastre alternas sincrónicas". Electroforesis . 26 (1): 82–90. doi : 10.1002 / elps.200406140 . ISSN 0173-0835 . PMID 15624147 .
- ^ a b c Pel, Joel; Broemeling, David; Mai, Laura; Poon, Hau-Ling; Tropini, Giorgia; Warren, René L .; Holt, Robert A .; Marziali, Andre (1 de septiembre de 2009). "La respuesta electroforética no lineal produce un parámetro único para la separación de biomoléculas" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 106 (35): 14796-14801. Código bibliográfico : 2009PNAS..10614796P . doi : 10.1073 / pnas.0907402106 . ISSN 0027-8424 . PMC 2728113 . PMID 19706437 .
- ^ Joel, Pel (2009). Un nuevo mecanismo electroforético y parámetro de separación para la concentración selectiva de ácido nucleico basado en el coeficiente síncrono de alteración de arrastre (SCODA) (Tesis). Universidad de Columbia Britanica. doi : 10.14288 / 1.0067696 . hdl : 2429/13402 .
- ^ Voordouw, Gerrit. "Descubriendo la diversidad microbiana de las arenas petrolíferas de Alberta a través de la metagenómica: un trampolín para una recuperación de petróleo mejorada y soluciones ambientales" (PDF) . Genoma de Alberta . Consultado el 20 de abril de 2016 .
- ^ Engel, Katja; Pinnell, Lee; Cheng, Jiujun; Charles, Trevor C .; Neufeld, Josh D. (1 de enero de 2012). "Electroforesis no lineal para la purificación del ADN del suelo para metagenómica". Revista de métodos microbiológicos . 88 (1): 35–40. doi : 10.1016 / j.mimet.2011.10.007 . PMID 22056233 .
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- ^ Thompson, Jason D .; Shibahara, Gosuke; Rajan, Sweta; Pel, Joel; Marziali, Andre (15 de febrero de 2012). "Aventar ADN para secuencias raras: enriquecimiento basado en metilación y secuencia altamente específica" . PLOS ONE . 7 (2): e31597. Código bibliográfico : 2012PLoSO ... 731597T . doi : 10.1371 / journal.pone.0031597 . ISSN 1932-6203 . PMC 3280224 . PMID 22355378 .
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|journal=
( ayuda ) - ^ Kidess, Evelyn; Heirich, Kyra; Wiggin, Matthew; Vysotskaia, Valentina; Visser, Brendan C .; Marziali, Andre; Wiedenmann, Bertram; Norton, Jeffrey A .; Lee, Mark (10 de febrero de 2015). "Perfil de mutación del ADN tumoral de plasma y tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal con una nueva plataforma de detección de mutaciones multiplexadas de alta sensibilidad" . Oncotarget . 6 (4): 2549-2561. doi : 10.18632 / oncotarget.3041 . ISSN 1949-2553 . PMC 4385870 . PMID 25575824 .