La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, comúnmente conocida como NASBA , es un método en biología molecular que se usa para producir múltiples copias de ARN monocatenario. [1] NASBA es un proceso de dos pasos que toma ARN y hibrida de cebadores especialmente diseñados, luego utiliza un cóctel de enzimas para amplificarlo. [2]
Fondo
La amplificación de ácidos nucleicos es una técnica que se utiliza para producir varias copias de un segmento específico de ARN / ADN. [3] El ARN y el ADN amplificados se pueden usar para una variedad de aplicaciones, como genotipificación, secuenciación y detección de bacterias o virus. [4] Hay dos tipos diferentes de amplificación, no isotérmica e isotérmica. [5] La amplificación no isotérmica produce múltiples copias de ARN / ADN mediante ciclos reiterativos entre diferentes temperaturas. [6] La amplificación isotérmica produce múltiples copias de ARN / ADN a una temperatura de reacción constante. [7] NASBA toma ARN monocatenario, hibrida con cebadores a 65 y luego lo amplifica a 41 para producir múltiples copias de ARN monocatenario. [8] Para que ocurra una amplificación exitosa, se usa un cóctel de enzimas que contiene transcriptasa inversa de mieloblastosis aviar (AMV-RT), ARNasa H y ARN polimerasa. [9] AMV-RT sintetiza una hebra de ADN complementaria (ADNc) a partir de la plantilla de ARN una vez que se hibrida el cebador. [10] La ARNasa H luego degrada la plantilla de ARN y el otro cebador se une al ADNc para formar ADN bicatenario, que la ARN polimerasa utiliza para sintetizar copias de ARN. [11] Un aspecto clave de NASBA es que el material de partida y el producto final es siempre ARN monocatenario. Dicho esto, se puede usar para amplificar el ADN, pero el ADN debe traducirse en ARN para que se produzca una amplificación exitosa.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es otra técnica de amplificación isotérmica.
Historia
NASBA fue desarrollado por J Compton en 1991, quien lo definió como "una tecnología dependiente de cebadores que se puede utilizar para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una sola mezcla a una temperatura". [12] Inmediatamente después de la invención de NASBA se utilizó para el diagnóstico rápido y la cuantificación del VIH-1 en sueros de pacientes. [13] Aunque el ARN también se puede amplificar mediante PCR utilizando una transcriptasa inversa (para sintetizar una hebra de ADN complementaria como plantilla), la principal ventaja de NASBA es que funciona en condiciones isotérmicas, generalmente a una temperatura constante de 41 ° C o dos temperaturas diferentes, dependiendo de los cebadores y enzimas utilizados. Incluso cuando se aplican dos temperaturas diferentes, todavía se considera isotérmico, porque no alterna entre esas temperaturas. NASBA se puede utilizar en diagnósticos médicos como una alternativa a la PCR que es más rápida y más sensible en algunas circunstancias. [14]
Procedimiento
Explicado brevemente, NASBA funciona de la siguiente manera:
- La plantilla de ARN añadida a la mezcla de reacción, el primer cebador con la región promotora de T7 en su extremo 5 'se une a su sitio complementario en el extremo 3' de la plantilla.
- La transcriptasa inversa sintetiza la hebra de ADN complementaria opuesta extendiendo el extremo 3 'del cebador, moviéndose corriente arriba a lo largo de la plantilla de ARN.
- La ARNasa H destruye la plantilla de ARN del compuesto ADN-ARN (la ARNasa H solo destruye el ARN en los híbridos ARN-ADN, pero no el ARN monocatenario).
- El segundo cebador se adhiere al extremo 5 'de la cadena de ADN (antisentido).
- La transcriptasa inversa vuelve a sintetizar otra hebra de ADN a partir del cebador adjunto, lo que da como resultado un ADN de doble hebra.
- La ARN polimerasa de T7 se une a la región promotora en la doble hebra. Dado que la ARN polimerasa T7 solo puede transcribir en la dirección 3 'a 5' [15], el ADN sentido se transcribe y se produce un ARN antisentido. Esto se repite y la polimerasa produce continuamente cadenas de ARN complementarias de esta plantilla, lo que da como resultado una amplificación.
- Ahora puede comenzar una fase cíclica similar a los pasos anteriores. Aquí, sin embargo, el segundo cebador se une primero al (-) ARN
- La transcriptasa inversa ahora produce un dúplex (+) cDNA / (-) RNA.
- La ARNasa H vuelve a degradar el ARN y el primer cebador se une al ahora monocatenario + (ADNc)
- La transcriptasa inversa ahora produce el ADN complementario (-), creando un dúplex de dsDNA
- Exactamente como en el paso 6, la polimerasa T7 se une a la región promotora para producir (-) ARN y el ciclo se completa.
Aplicaciones clínicas
La técnica NASBA se ha utilizado para desarrollar pruebas de diagnóstico rápido para varios virus patógenos con genomas de ARN monocatenario, por ejemplo, influenza A, [16] virus del zika, virus de la fiebre aftosa , [17] síndrome respiratorio agudo severo ( SARS ) -asociado coronavirus , [18] humano bocavirus (HBoV) [19] y también parásitos como Trypanosoma brucei . [20]
Ver también
Referencias
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