La ARN polimerasa de T7 es una ARN polimerasa del bacteriófago T7 que cataliza la formación de ARN a partir del ADN en la dirección 5 '→ 3'.
T7 ARN polimerasa | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | 1 | |||||
PDB | 1MSW | |||||
UniProt | P00573 | |||||
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Actividad
La polimerasa T7 es extremadamente específica del promotor y solo transcribe el ADN cadena abajo de un promotor T7. [1] La polimerasa T7 también requiere una plantilla de ADN de doble hebra y un ion Mg 2+ como cofactor para la síntesis de ARN. Tiene una tasa de error muy baja. La polimerasa T7 tiene un peso molecular de 99 kDa.
Promotor
El promotor es reconocido por la unión y el inicio de la transcripción. El consenso en T7 y fagos relacionados es: [1]
5 '* 3'T7 TAATACGACTCACTATAGGGAGAT3 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGAK11 AATTAGGGCACACTATAGGGAGASP6 ATTTACGACACACTATAGAAGAA unir------------ -----------en eso
La transcripción comienza en la guanina marcada con un asterisco. [1]
Estructura
La polimerasa T7 se ha cristalizado en varias formas y las estructuras se han colocado en el AP . Estos explican cómo la polimerasa T7 se une al ADN y lo transcribe. El dominio N-terminal se mueve a medida que se forma el complejo de alargamiento. El ssRNAP contiene un híbrido de ADN-ARN de 8 pb. [2] Un bucle de especificidad beta-horquilla (residuos 739-770 en T7) reconoce al promotor; cambiarlo por uno que se encuentra en T3 RNAP hace que la polimerasa reconozca a los promotores de T3 en su lugar. [1]
Similar a otras polimerasas de ácidos nucleicos virales , incluida la ADN polimerasa de T7 del mismo fago, el C-terminal conservado de T7 ssRNAP emplea un pliegue cuya organización se ha comparado con la forma de una mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. . [3] El N-terminal está menos conservado. Forma un dominio de unión al promotor (PBD) con haces de hélice en los ssRNAP del fago, [4] una característica que no se encuentra en los ssRNAP mitocondriales. [5]
Proteínas relacionadas
ARN polimerasa dirigida por ADN, tipo fago | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | RNA_pol | |||||||
Pfam | PF00940 | |||||||
InterPro | IPR002092 | |||||||
SCOP2 | 1msw / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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La polimerasa T7 es un miembro representativo de la familia RNAP dependiente de ADN de subunidad única (ssRNAP). Otros miembros incluyen las ARN polimerasas del fago T3 y SP6, la ARN polimerasa mitocondrial ( POLRMT ) y la ssRNAP cloroplástica. [6] [7] La familia ssRNAP es estructural y evolutivamente distinta de la familia de múltiples subunidades de ARN polimerasas (incluidas las subfamilias bacterianas y eucariotas). A diferencia de las ARN polimerasas bacterianas, la polimerasa T7 no es inhibida por el antibiótico rifampicina . Esta familia está relacionada con la transcriptasa inversa de una sola subunidad y la ADN polimerasa . [8]
Solicitud
En aplicaciones de biotecnología, la ARN polimerasa T7 se usa comúnmente para transcribir ADN que ha sido clonado en vectores que tienen dos (diferentes) promotores de fagos (por ejemplo, T7 y T3, o T7 y SP6) en orientación opuesta. El ARN se puede sintetizar selectivamente a partir de cualquier hebra del ADN de inserción con las diferentes polimerasas. La enzima es estimulada por espermidina y la actividad in vitro aumenta por la presencia de proteínas transportadoras (como BSA ) [9] [10]
Con este sistema se puede generar ARN monocatenario marcado homogéneamente. Las transcripciones pueden marcarse de forma no radiactiva hasta una actividad específica alta con ciertos nucleótidos marcados.
Referencias
- ↑ a b c d Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK (enero de 1998). "Determinantes de la especificidad del promotor de la ARN polimerasa de T7" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 95 (2): 515–9. Código Bibliográfico : 1998PNAS ... 95..515R . doi : 10.1073 / pnas.95.2.515 . PMC 1845 . PMID 9435223 .
- ^ Tahirov TH, Temiakov D, Anikin M, Patlan V, McAllister WT, Vassylyev DG, Yokoyama S (noviembre de 2002). "Estructura de un complejo de elongación de la polimerasa de ARN de T7 a una resolución de 2,9 A". Naturaleza . 420 (6911): 43–50. doi : 10.1038 / nature01129 . PMID 12422209 .
- ^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (agosto de 1997). "Estructura de la ARN polimerasa dependiente de ARN de poliovirus". Estructura . 5 (8): 1109–22. doi : 10.1016 / S0969-2126 (97) 00261-X . PMID 9309225 .
- ^ Durniak KJ, Bailey S, Steitz TA (octubre de 2008). "La estructura de una ARN polimerasa de transcripción de T7 en transición desde el inicio hasta el alargamiento" . Ciencia . 322 (5901): 553–7. Código Bibliográfico : 2008Sci ... 322..553D . doi : 10.1126 / science.1163433 . PMC 2892258 . PMID 18948533 .
- ^ Hillen HS, Morozov YI, Sarfallah A, Temiakov D, Cramer P (noviembre de 2017). "Base estructural de la iniciación de la transcripción mitocondrial" . Celular . 171 (5): 1072–1081.e10. doi : 10.1016 / j.cell.2017.10.036 . PMC 6590061 . PMID 29149603 .
- ^ McAllister WT, Raskin CA (octubre de 1993). "Las ARN polimerasas de fagos están relacionadas con las ADN polimerasas y las transcriptasas inversas". Microbiología molecular . 10 (1): 1–6. doi : 10.1111 / j.1365-2958.1993.tb00897.x . PMID 7526118 .
- ^ Hedtke B, Börner T, Weihe A (agosto de 1997). "Polimerasas de ARN de tipo fago mitocondrial y cloroplasto en Arabidopsis". Ciencia . 277 (5327): 809-11. doi : 10.1126 / science.277.5327.809 . PMID 9242608 .
- ^ Cermakian N, Ikeda TM, Miramontes P, Lang BF, Gray MW, Cedergren R (diciembre de 1997). "Sobre la evolución de las ARN polimerasas de una sola subunidad" . Revista de evolución molecular . 45 (6): 671–81. Código bibliográfico : 1997JMolE..45..671C . CiteSeerX 10.1.1.520.3555 . doi : 10.1007 / PL00006271 . PMID 9419244 .
- ^ Chamberlin M, Ring J (marzo de 1973). "Caracterización de la polimerasa de ácido ribonucleico específico de T7. 1. Propiedades generales de la reacción enzimática y la especificidad de la plantilla de la enzima". La revista de química biológica . 248 (6): 2235–44. PMID 4570474 .
- ^ Maslak M, Martin CT (junio de 1994). "Efectos de las condiciones de la solución sobre la cinética de estado estacionario del inicio de la transcripción por la polimerasa de ARN T7". Bioquímica . 33 (22): 6918–24. doi : 10.1021 / bi00188a022 . PMID 7911327 .
Otras lecturas
- Martin CT, Esposito EA, Theis K, Gong P (2005). "Estructura y función en el escape del promotor por T7 RNA polimerasa". Avances en investigación de ácidos nucleicos y biología molecular . 80 : 323–47. doi : 10.1016 / S0079-6603 (05) 80008-X . ISBN 9780125400800. PMID 16164978 .
- Sousa R, Mukherjee S (2003). "T7 ARN polimerasa". Avances en investigación de ácidos nucleicos y biología molecular . 73 : 1-41. doi : 10.1016 / S0079-6603 (03) 01001-8 . ISBN 9780125400732. PMID 12882513 .
- McAllister WT (1993). "Estructura y función del bacteriófago T7 ARN polimerasa (o, las virtudes de la simplicidad)". Investigación en Biología Celular y Molecular . 39 (4): 385–91. PMID 8312975 .
- Sastry SS, Ross BM (marzo de 1997). "Actividad nucleasa de la ARN polimerasa de T7 y la heterogeneidad de los complejos de elongación de la transcripción" . La revista de química biológica . 272 (13): 8644–52. doi : 10.1074 / jbc.272.13.8644 . PMID 9079696 . - tenga en cuenta que la actividad nucleasa que se informa aquí es un artefacto.
- Chamberlin M, Ring J (marzo de 1973). "Caracterización de la polimerasa de ácido ribonucleico específico de T7. 1. Propiedades generales de la reacción enzimática y la especificidad de la plantilla de la enzima". La revista de química biológica . 248 (6): 2235–44. PMID 4570474 .
- Maslak M, Martin CT (junio de 1994). "Efectos de las condiciones de la solución sobre la cinética de estado estacionario del inicio de la transcripción por la polimerasa de ARN T7". Bioquímica . 33 (22): 6918–24. doi : 10.1021 / bi00188a022 . PMID 7911327 .
enlaces externos
- Enzimología de la ARN polimerasa T7
- OpenWetWare