NanoSIMS (espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala ) es un instrumento analítico fabricado por CAMECA que opera según el principio de espectrometría de masas de iones secundarios . [1] El NanoSIMS se utiliza para adquirir medidas de resolución a nanoescala de la composición elemental e isotópica de una muestra. El NanoSIMS puede crear mapas a nanoescala de distribución elemental o isotópica, adquisición paralela de hasta siete masas, identificación isotópica , alta resolución de masa, sensibilidad de subpartes por millón con resolución espacial de hasta 50 nm. [2]
El diseño original del instrumento NanoSIMS fue concebido por Georges Slodzian en la Universidad de Paris Sud en Francia . [3] Actualmente existen alrededor de 50 instrumentos NanoSIMS en todo el mundo. [4]
Cómo funciona
El NanoSIMS utiliza una fuente de iones para producir un haz primario de iones. Estos iones primarios erosionan la superficie de la muestra y producen colisiones atómicas, algunas de las cuales resultan en la liberación de partículas de iones secundarios. Estos iones se transmiten a través de un espectrómetro de masas, donde se miden e identifican las masas. [5] El haz de iones primario puede trazar la muestra y crear un 'mapa' del elemento y la distribución de isótopos contando el número de iones que se originaron en cada punto con una resolución de hasta 50 nanómetros (nm), de 10 a 50 veces mayor que los SIMS convencionales. [6] [7] Esto se logra colocando la sonda primaria muy cerca de la muestra. [8] El haz de iones primario impacta la superficie de la muestra a 90 °, con los iones secundarios extraídos a través del mismo conjunto de lentes. Esto permite distinguir la composición isotópica de las células individuales en el rango de partes por millón (ppm) o partes por billón (ppb).
NanoSIMS puede detectar diferencias de masa diminutas entre iones con una resolución de M / dM> 5000, donde M es la masa nominal del isótopo y dM es la diferencia de masa entre los isótopos de interés. [9] Las capacidades de alta resolución de masa de NanoSIMS permiten que diferentes elementos y sus isótopos sean identificados y mapeados espacialmente en la muestra, incluso si tienen una masa muy cercana. El espectrómetro de masas es capaz de realizar múltiples recolecciones, lo que significa que se pueden detectar simultáneamente hasta 5 (NanoSIMS 50) o 7 (NanoSIMS 50 L) masas, desde hidrógeno hasta uranio, aunque con limitaciones. [5] [7] El número relativamente grande de masas ayuda a eliminar los errores de medición ya que se evitan los posibles cambios en las condiciones instrumentales o de la muestra que pueden ocurrir entre corridas. [9]
El haz de iones debe configurarse para detectar iones negativos o positivos, comúnmente completado mediante el uso de un haz de Cesio + u Oxígeno-, respectivamente. [10] Esta alta resolución de masa es particularmente relevante para aplicaciones biológicas. Por ejemplo, el nitrógeno es uno de los elementos más comunes en los organismos. Sin embargo, debido a la baja afinidad electrónica del átomo de nitrógeno, la producción de iones secundarios es rara. En cambio, se pueden generar y medir moléculas como el CN. Sin embargo, debido a combinaciones de isótopos (como las isobaras 13 C 14 N- y 12 C 15 N-), se generarán pesos moleculares casi idénticos de 27.000 y 27.006 daltons, respectivamente. A diferencia de otras técnicas de imagen, en las que 13 C 14 N y 12 C 15 N no se pueden medir de forma independiente debido a masas casi idénticas, NanoSIMS puede distinguir con seguridad las diferencias entre estas moléculas. [10]
La física de NanoSIMS
El espectrómetro de masas de sector magnético provoca una separación física de iones de diferente relación masa / carga . La separación física de los iones secundarios es causada por la fuerza de Lorentz cuando los iones pasan a través de un campo magnético que es perpendicular al vector de velocidad de los iones secundarios. La fuerza de Lorentz establece que una partícula experimentará una fuerza
cuando mantiene una carga q y viaja a través de un campo eléctrico E y un campo magnético B con una velocidad v . Los iones secundarios que abandonan la superficie de la muestra suelen tener una energía cinética de unos pocos electronvoltios (eV), aunque se ha descubierto que una parte bastante pequeña tiene una energía de unos pocos keV. Un campo electrostático captura los iones secundarios que abandonan la superficie de la muestra; estos iones extraídos se transfieren luego a un espectrómetro de masas. Para lograr mediciones isotópicas precisas , existe la necesidad de una alta transmisión y una alta resolución de masa . La alta transmisión se refiere a la baja pérdida de iones secundarios entre la superficie de la muestra y el detector, y la alta resolución de masa se refiere a la capacidad de separar eficientemente los iones secundarios (o moléculas de interés) de otros iones y / o iones de masa similar. Los iones primarios chocarán con la superficie a una frecuencia específica por unidad de superficie. La colisión que ocurre hace que los átomos salpiquen de la superficie de la muestra, y de estos átomos solo una pequeña cantidad sufrirá ionización. Estos se convierten en iones secundarios, que luego se detectan después de la transferencia a través del espectrómetro de masas. Cada ión primario genera una serie de iones secundarios de un isótopo que llegarán al detector para ser contados. La tasa de recuento está determinada por
donde I ( i M) es la tasa de conteo del isótopo i M de elemento M . La tasa de recuento del isótopo depende de la concentración, X M y de la abundancia isotópica del elemento , denominada A i . Debido a que el haz de iones primario determina los iones secundarios, Y , que son bombardeados, la densidad del haz de iones primario, d b , que se define como la cantidad de iones por segundo por unidad de superficie, afectará una porción de la superficie. área de la muestra, S , con una distribución uniforme de los iones primarios. De los iones secundarios pulverizados, solo hay una fracción que se ionizará, Y i . La probabilidad de que cualquier ión será transferido con éxito de espectrómetro de masas para detector es T . El producto de Y i y T determina la cantidad de isótopos que serán ionizados, así como detectados, por lo que se considera el rendimiento útil. [11]
Preparación de la muestra
La preparación de muestras es uno de los pasos más críticos en el análisis NanoSIMS, particularmente cuando se analizan muestras biológicas. [12] Deben desarrollarse protocolos específicos para experimentos individuales con el fin de preservar mejor no solo la estructura de la muestra, sino también la verdadera distribución espacial y la abundancia de moléculas dentro de la muestra. A medida que el NanoSIMS opera bajo ultra alto vacío , la muestra debe ser de vacío compatible (es decir, volátil gratis), plana, que reduce variando las trayectorias de ionización, y conductora, que puede ser consumado revestimiento por bombardeo iónico con Au , Pt , o C . Las muestras biológicas, como células o tejidos, se pueden fijar e incrustar en una resina antes de seccionarlas en rodajas finas (100 nm - 1 μm) y colocarlas en obleas de silicio o portaobjetos para su análisis. [12]
Aplicaciones
NanoSIMS puede capturar la variabilidad espacial de mediciones isotópicas y elementales de áreas submicrométricas, granos o inclusiones de muestras geológicas, de ciencia de materiales y biológicas. [13] Este instrumento puede caracterizar materiales nanoestructurados con composición compleja que son candidatos cada vez más importantes para la generación y almacenamiento de energía.
Aplicaciones geológicas
NanoSIMS también ha demostrado ser útil en el estudio de cuestiones cosmoquímicas , donde se pueden analizar muestras de granos de tamaño simple, micro o submicrométrico de meteoritos, así como secciones de micrótomo preparadas mediante la técnica de haz de iones enfocados (FIB). NanoSIMS se puede combinar con microscopía electrónica de transmisión (TEM) cuando se utilizan secciones de micrótomo o FIB. Esta combinación permite estudios mineralógicos e isotópicos correlacionados in situ a una escala submicrométrica.
Es particularmente útil en la investigación de materiales debido a su alta sensibilidad a alta resolución de masa, que permite la obtención de imágenes y cuantificación de elementos traza. [14]
Aplicaciones biológicas
Desarrollado inicialmente para investigación geoquímica y afines, NanoSIMS ahora se utiliza en una amplia variedad de campos, incluidos la biología y la microbiología. En la investigación biomédica, NanoSIMS también se conoce como espectrometría de masas de imágenes de isótopos múltiples (MIMS). [15] La resolución de 50 nm permite una resolución sin precedentes de las características celulares y subcelulares (como referencia, el organismo modelo E. coli tiene típicamente entre 1000 y 2000 nm de diámetro). La alta resolución que ofrece permite la medición intracelular de acumulaciones y flujos de moléculas que contienen varios isótopos estables. [16] NanoSIMS se puede utilizar para cultivos puros, co-cultivos y muestras de comunidades mixtas. [9]
El primer uso de NanoSIMS en biología fue por Peteranderl y Lechene en 2004, quienes utilizaron un prototipo de NanoSIMS para examinar y medir isótopos de carbono y nitrógeno de células eucariotas. Este estudio fue la primera vez que las proporciones de isótopos de carbono y nitrógeno se midieron directamente a escala subcelular en una muestra biológica. [17]
Aplicaciones de ciencia de materiales
El NanoSIMS se ha utilizado en muchas áreas diferentes de la ciencia de los materiales. [4] Es capaz de mapear el hidrógeno y el deuterio a escalas microestructurales relevantes, lo cual es importante para los estudios de fragilización por hidrógeno en metales [18], aunque existen desafíos significativos asociados con la detección precisa de hidrógeno y deuterio. [19]
Métodos comúnmente acoplados con NanoSIMS
Microscopía
Otras técnicas de microscopía se utilizan comúnmente en conjunto con NanoSIMS que permiten obtener múltiples tipos de información, como información taxonómica a través de hibridación fluorescente in situ (FISH) [20] o identificación de características fisiológicas adicionales a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM) o microscopía electrónica de barrido (SEM).
Etiquetado inmunológico
Los métodos tradicionales que se utilizan para etiquetar e identificar las características subcelulares de las células, como el marcaje con inmunooro, también se pueden utilizar con el análisis NanoSIMS. El etiquetado de Immunogold utiliza anticuerpos para atacar proteínas específicas y, posteriormente, marca los anticuerpos con nanopartículas de oro. El instrumento NanoSIMS puede detectar las partículas de oro, proporcionando la ubicación de las proteínas marcadas con una resolución de alta escala. Se obtuvieron imágenes de compuestos que contienen oro o platino utilizados como medicamentos contra el cáncer usando NanoSIMS para examinar la distribución subcelular en las células de cáncer de mama y de colon, respectivamente. [21] En un estudio separado, se estudió la unión anticuerpo-antígeno sin la necesidad de agregar una etiqueta fluorescente al anticuerpo, lo que permite la localización sin etiqueta y el análisis cuantitativo a alta resolución. [22]
Etiquetado de isótopos estables
Otra técnica común que se usa típicamente en el análisis NanoSIMS es el sondeo de isótopos estables. Este método implica la introducción de compuestos biológicamente relevantes marcados isotópicamente estables en organismos para su consumo e integración en materia orgánica. Cuando se analiza mediante NanoSIMS, la técnica se denomina nanoSIP. [23] NanoSIMS se puede utilizar para detectar qué organismos incorporaron qué moléculas, qué cantidad de las moléculas marcadas se incorporaron de manera semicuantitativa y en qué lugar de la célula se produjo la incorporación. Las técnicas de análisis cuantitativo anteriores a una resolución más baja que NanoSIMS de moléculas marcadas isotópicamente estables se limitaron al material a granel analizado, lo que no permitió obtener información sobre las contribuciones de células individuales o compartimentos subcelulares. [24] Además, la eliminación de moléculas extrañas grandes (como anticuerpos o partículas de oro) de la configuración experimental alivia las preocupaciones de que las moléculas marcadas requeridas para otras técnicas de microscopía pueden tener diferentes respuestas bioquímicas o propiedades de lo normal.
Esta técnica se puede utilizar para estudiar el intercambio de nutrientes. Se investigó el microbioma intestinal del ratón para determinar qué microbios se alimentaban de compuestos derivados del huésped. Para ello, los ratones recibieron alimentos enriquecidos con los aminoácidos marcados isotópicamente estables y se examinó la biomasa microbiana. [25] NanoSIMS permite examinar las contribuciones metabólicas de microbios individuales. NanoSIMS se utilizó para estudiar y probar por primera vez las capacidades de fijación de nitrógeno de las bacterias y arqueas de las profundidades del océano mediante el suministro de compuestos que contienen nitrógeno 15 N a las muestras de sedimentos. [26] NanoSIMS también se puede utilizar para estimar la tasa de crecimiento de organismos, ya que la cantidad de carbono u otro sustrato acumulado dentro de la célula permite estimar cuánta biomasa se está generando. [27]
Medición de la abundancia de isótopos naturales en organismos
El material orgánico contiene naturalmente isótopos estables en diferentes proporciones en el medio ambiente, lo que puede proporcionar información sobre el origen de la fuente de alimento para los organismos. Los diferentes tipos de material orgánico de las fuentes alimenticias tienen diferentes cantidades de isótopos estables, lo que se refleja en la composición del organismo que ingiere estas fuentes alimenticias. [28] Este tipo de análisis se utilizó por primera vez en 2001 junto con FISH para examinar las relaciones sintróficas entre arqueas anaeróbicas oxidantes de metano y bacterias reductoras de sulfato. [29] Es posible que los isótopos con abundancias naturalmente bajas no se puedan detectar con este método.
Paleobiología
NanoSIMS también se puede utilizar para examinar la composición elemental e isotópica de micropartículas conservadas en el registro de rocas. [6] Los tipos de elementos y las proporciones isotópicas pueden ayudar a determinar si el material es de origen biológico. [9] NanoSIMS se utilizó por primera vez en este campo de la paleobiología en 2005 por Robert et al. [30] En este estudio, se encontró que los microfósiles contienen elementos de carbono, nitrógeno y azufre dispuestos como "glóbulos" que recuerdan a las paredes celulares. La proporción de carbono a nitrógeno medida también sirvió como indicador de origen biológico, ya que la roca que rodeaba los fósiles tenía proporciones de C a N muy diferentes. [6]
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