Determinación de la estructura de ácidos nucleicos


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Los enfoques experimentales para determinar la estructura de ácidos nucleicos , como el ARN y el ADN , pueden clasificarse en gran medida en métodos biofísicos y bioquímicos . Los métodos biofísicos utilizan las propiedades físicas fundamentales de las moléculas para la determinación de la estructura, incluida la cristalografía de rayos X , la RMN y la crio-EM . Los métodos bioquímicos explotan las propiedades químicas de los ácidos nucleicos utilizando reactivos y condiciones específicos para analizar la estructura de los ácidos nucleicos. [1]Dichos métodos pueden implicar un sondeo químico con reactivos específicos o depender de la química nativa o análoga . Los diferentes enfoques experimentales tienen méritos únicos y son adecuados para diferentes propósitos experimentales.

Métodos biofísicos

Cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X no es común para los ácidos nucleicos solos, ya que ni el ADN ni el ARN forman cristales fácilmente. Esto se debe al mayor grado de desorden intrínseco y dinamismo en las estructuras de ácidos nucleicos y las cadenas principales cargadas negativamente (desoxi) ribosa-fosfato, que se repelen entre sí en estrecha proximidad. Por lo tanto, los ácidos nucleicos cristalizados tienden a formar complejos con una proteína de interés para proporcionar un orden estructural y neutralizar la carga negativa. [ cita requerida ]

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

La RMN de ácido nucleico es el uso de la espectroscopia de RMN para obtener información sobre la estructura y dinámica de las moléculas de ácido nucleico , como el ADN o el ARN . En 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopía de RMN. [2]

La RMN de ácido nucleico utiliza técnicas similares a la RMN de proteínas, pero tiene varias diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un porcentaje más pequeño de átomos de hidrógeno, que son los átomos que normalmente se observan en la RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". [3] Los tipos de RMN hace generalmente con los ácidos nucleicos son 1 H o RMN de protón , 13 C RMN , 15 N de RMN , y 31 P RMN . RMN bidimensionalCasi siempre se utilizan métodos, como la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares de enlace directo, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos cercanos entre sí en el espacio. . [4]

Los parámetros tomados del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , se pueden usar para determinar características estructurales locales como ángulos de enlace glicosídico, ángulos diedros (usando la ecuación de Karplus ) y conformaciones de fruncido de azúcar. Para estructuras a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otros supuestos o modelos estructurales, porque los errores se suman a medida que se atraviesa la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto y no se pliega hacia atrás. sí mismo. La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar, como hélices dobladas , emparejamiento de bases que no son de Watson-Crick y apilamiento coaxial.. Ha sido especialmente útil en el sondeo de la estructura de oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas, tales como tallo de bucles y pseudoknots . La RMN también es útil para sondear la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, tales como proteínas o fármacos, al ver qué resonancias se desplazan tras la unión de la otra molécula. [4]

Microscopía electrónica criogénica (cryo-EM)

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) es una técnica que utiliza un haz de electrones para obtener imágenes de muestras que se han conservado criogénicamente en una solución acuosa. Las muestras líquidas se pipetean en pequeñas rejillas metálicas y se sumergen en una solución líquida de etano / propano que se mantiene extremadamente fría mediante un baño de nitrógeno líquido. Tras este proceso de congelación, las moléculas de agua en la muestra no tienen tiempo suficiente para formar celosías hexagonales como las que se encuentran en el hielo y, por lo tanto, la muestra se conserva en un estado cristalino similar al agua (también conocido como hielo vitrificado).), lo que facilita la obtención de imágenes de estas muestras utilizando el haz de electrones. Una ventaja de la crio-EM sobre la cristalografía de rayos X es que las muestras se conservan en su estado de solución acuosa y no se alteran formando un cristal de la muestra. Una desventaja es que es difícil resolver estructuras de ácidos nucleicos o proteínas que son menores de ~ 75 kilodaltons , en parte debido a la dificultad de tener suficiente contraste para ubicar partículas en esta solución acuosa vitrificada. Otra desventaja es que para obtener información de estructura a nivel atómico sobre una muestra se requiere tomar muchas imágenes (a menudo denominadas micrografías electrónicas) y promediar esas imágenes en un proceso llamado reconstrucción de una sola partícula . Este es un proceso computacionalmente intensivo.

Cryo-EM es una versión más nueva y menos perturbadora de la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Es menos perturbador porque la muestra no se seca sobre una superficie, este proceso de secado a menudo se realiza en TEM con tinción negativa y porque Cryo-EM no requiere agentes de contraste como las sales de metales pesados ​​(por ejemplo, acetato de uranilo o ácido fosotúngstico) que también puede afectar la estructura de la biomolécula. La microscopía electrónica de transmisión, como técnica, utiliza el hecho de que las muestras interactúan con un haz de electrones y solo las partes de la muestra que no interactúan con el haz de electrones pueden "transmitir" al sistema de detección de electrones. TEM, en general, ha sido una técnica útil para determinar la estructura del ácido nucleico desde la década de 1960. [5] [6]Si bien la estructura del ADN bicatenario (dsDNA) puede no considerarse tradicionalmente como estructura, en el sentido típico de segmentos alternos de regiones monocatenarias y bicatenarias, en realidad, el dsDNA no es simplemente una doble hélice perfectamente ordenada en cada ubicación de su longitud. debido a fluctuaciones térmicas en el ADN y estructuras alternativas que pueden formarse como g-cuadruplex . Se ha realizado crioEM de ácido nucleico en ribosomas, [7] ARN viral [8] y estructuras de ARN monocatenario dentro de virus. [9] [10] Estos estudios han resuelto características estructurales en diferentes resoluciones desde el nivel de la nucleobase (2-3 angstroms) hasta los motivos de la estructura terciaria (más de un nanómetro).

Sondeo químico

Una figura esquemática que explica los pasos de un experimento de sondeo químico típico para analizar la estructura de moléculas de ARN.

El sondeo químico de ARN utiliza sustancias químicas que reaccionan con los ARN. Es importante destacar que su reactividad depende de la estructura del ARN local, por ejemplo, emparejamiento de bases o accesibilidad. Por tanto, las diferencias de reactividad pueden servir como huella de estructura a lo largo de la secuencia. Los diferentes reactivos reaccionan en diferentes posiciones en la estructura del ARN y tienen diferentes espectros de reactividad. [1] Los avances recientes permiten el estudio simultáneo de la estructura de muchos ARN (sondeo en todo el transcriptoma) [11] y el ensayo directo de moléculas de ARN en su entorno celular (sondeo en la célula). [12]

El ARN estructurado se hace reaccionar primero con los reactivos de sondeo durante un tiempo de incubación determinado. Estos reactivos formarían un aducto covalente sobre el ARN en el sitio de reacción. Cuando el ARN se transcribe de forma inversa utilizando una transcriptasa inversa en una copia de ADN, el ADN generado se trunca en las posiciones de reacción porque la enzima está bloqueada por los aductos. La colección de moléculas de ADN de varias longitudes truncadas, por lo tanto, informa la frecuencia de reacción en cada posición de base, lo que refleja el perfil de la estructura a lo largo del ARN. Esto se analiza tradicionalmente ejecutando el ADN en un gel , y la intensidad de las bandas informa la frecuencia de observar un truncamiento en cada posición. Uso de enfoques recientessecuenciación de alto rendimiento para lograr el mismo propósito con mayor rendimiento y sensibilidad.

El perfil de reactividad puede usarse para estudiar el grado de estructura en posiciones particulares para hipótesis específicas, o usarse junto con algoritmos computacionales para producir un modelo de estructura completo con soporte experimental. [13]

Dependiendo del reactivo químico utilizado, algunos reactivos, por ejemplo, radicales hidroxilo, escindirían la molécula de ARN en su lugar. El resultado en el ADN truncado es el mismo. Algunos reactivos, por ejemplo, DMS, a veces no bloquean la transcriptasa inversa, sino que provocan un error en el sitio de la copia del ADN. Estos se pueden detectar cuando se utilizan métodos de secuenciación de alto rendimiento y, a veces, se emplean para mejorar los resultados del sondeo como perfiles mutacionales (MaP). [14] [15]

Las posiciones en el ARN pueden protegerse de los reactivos no solo por la estructura local sino también por una proteína de unión sobre esa posición. Esto ha llevado a algunos trabajos a utilizar sondas químicas para analizar también la unión a proteínas. [dieciséis]

Sondeo de radicales hidroxilo

Gel de sonda de radicales hidroxilo que muestra bandas en las posiciones y puntos que indican la fuerza de protección. [17]

Como los radicales hidroxilo son de corta duración en solución, deben generarse en el experimento. Esto se puede hacer usando H 2 O 2 , ácido ascórbico y complejo Fe (II) -EDTA. Estos reactivos forman un sistema que genera radicales hidroxilo a través de la química de Fenton . Los radicales hidroxilo pueden entonces reaccionar con las moléculas de ácido nucleico. [17] Los radicales hidroxilo atacan el anillo de ribosa / desoxirribosa y esto da como resultado la rotura de la estructura de azúcar-fosfato. Los sitios bajo protección de las proteínas de unión o la estructura terciaria del ARN serían escindidos por el radical hidroxilo a una velocidad menor. [17] Por lo tanto, estas posiciones se mostrarían como ausencia de bandas en el gel o señal baja a través de la secuenciación. [17][18]

DMS

El dimetilsulfato , conocido como DMS, es una sustancia química que se puede utilizar para modificar ácidos nucleicos con el fin de determinar la estructura secundaria. La reacción con DMS agrega un aducto de metilo en el sitio, conocido como metilación . En particular, el DMS metila el N1 de la adenina (A) y el N3 de la citosina (C) , [19] ambos ubicados en el sitio de los enlaces de hidrógeno naturales tras el apareamiento de bases. Por lo tanto, la modificación solo puede ocurrir en las nucleobases A y C que son monocatenarias, pares de bases al final de una hélice o en un par de bases en o al lado de un par de oscilación GU, siendo las dos últimas posiciones donde el emparejamiento de bases puede abrirse ocasionalmente. Además, dado que los sitios modificados no pueden emparejarse con bases, los sitios de modificación pueden detectarse mediante RT-PCR, donde la transcriptasa inversa cae en las bases metiladas y produce diferentes ADNc truncados. Estos ADNc truncados se pueden identificar mediante electroforesis en gel o secuenciación de alto rendimiento.

Mejorando los métodos basados ​​en el truncamiento, el perfil mutacional de DMS con secuenciación (DMS-MaPseq) puede detectar múltiples modificaciones de DMS en una sola molécula de ARN, lo que permite que uno obtenga más información por lectura (para una lectura de 150 nt, típicamente dos o tres mutaciones sitios, en lugar de sitios de truncamiento de cero a uno), determinan estructuras de ARN de baja abundancia e identifican subpoblaciones de ARN con estructuras secundarias alternativas. [20] DMS-MaPseq utiliza una transcriptasa inversa de intrón termoestable del grupo II (TGIRT) que crea una mutación (en lugar de un truncamiento) en el ADNc.cuando encuentra una base metilada por DMS, pero por lo demás realiza una transcripción inversa con alta fidelidad. La secuenciación del ADNc resultante identifica qué bases se mutaron durante la transcripción inversa; estas bases no pueden haberse apareado en el ARN original.

La modificación de DMS también se puede usar para el ADN, por ejemplo, en la huella de interacciones ADN-proteína. [21]

FORMA

S electiva 2'- h ydroxyl un cylation analizó por p rimer e xtension, o SHAPE , se aprovecha de reactivos que modifican preferentemente la columna vertebral de ARN en regiones estructuralmente flexibles.

El anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7) se somete a hidrólisis para formar aductos en la columna vertebral de nucleótidos de ARN no apareados.

Los reactivos como el anhídrido N-metilisatoico (NMIA) y el anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7) [22] reaccionan con el grupo 2'-hidroxilo para formar aductos en el 2'-hidroxilo del esqueleto del ARN. En comparación con los productos químicos utilizados en otras técnicas de sondeo de ARN, estos reactivos tienen la ventaja de ser en gran medida no sesgados con respecto a la identidad de la base, mientras que siguen siendo muy sensibles a la dinámica conformacional. Los nucleótidos que están constreñidos (normalmente por apareamiento de bases) muestran menos formación de aductos que los nucleótidos que no están apareados. La formación de aductos se cuantifica para cada nucleótido en un ARN dado mediante la extensión de un cebador de ADN complementario con transcriptasa inversa y la comparación de los fragmentos resultantes con los de un control no modificado. [23] Por lo tanto, SHAPE informa sobre la estructura del ARN a nivel de nucleótidos individuales. Estos datos se pueden utilizar como entrada para generar modelos de estructura secundaria de alta precisión. [24] SHAPE se ha utilizado para analizar diversas estructuras de ARN, incluida la de un genoma completo del VIH-1. [25] El mejor enfoque es utilizar una combinación de reactivos de sondeo químico y datos experimentales. [26] En SHAPE-Seq, SHAPE se amplía mediante la multiplexación basada en códigos de barras combinada con RNA-Seq y se puede realizar con un alto rendimiento. [27]

Carbodiimidas

Estructura de la CMCT utilizada en el sondeo de la estructura del ARN
Mecanismo de reacción entre uracilo y carbodiimidas [28]

El resto carbodiimida también puede formar aductos covalentes en las nucleobases expuestas, que son uracilo y, en menor medida , guanina , tras el ataque nucleofílico de un N desprotonado. Reaccionan principalmente con N3 de uracilo y N1 de guanina modificando dos sitios responsables de los enlaces de hidrógeno en las bases. [19]

El meto- p- toluenosulfonato de 1-ciclohexil- (2-morfolinoetil) carbodiimida , también conocido como CMCT o CMC, es la carbodiimida más comúnmente utilizada para el sondeo de la estructura del ARN. [29] [30] Similar al DMS, se puede detectar mediante transcripción inversa seguida de electroforesis en gel o secuenciación de alto rendimiento. Como es reactivo frente a G y U, se puede utilizar para complementar los datos de los experimentos de sondeo de DMS, que informan a A y C. [31]

La 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida , también conocida como EDC, es una carbodiimida soluble en agua que exhibe una reactividad similar a la CMC y también se usa para el sondeo químico de la estructura del ARN. La EDC puede penetrar en las células y, por lo tanto, se utiliza para el sondeo directo de ARN dentro de la célula en sus entornos nativos. [32] [28]

Kethoxal, glyoxal y derivados

Kethoxal forma un aducto cíclico covalente sobre la guanina. [33]
Mecanismo de reacción entre 1,2-dicarbonilos y guanina. [34]

Algunos compuestos de 1,2-di carbonilo son capaces de reaccionar con guanina (G) monocatenaria en N1 y N2, formando un aducto de anillo de cinco miembros en la cara de Watson-Crick.

La 1,1-dihidroxi-3-etoxi-2-butanona, también conocida como cetoxal , tiene una estructura relacionada con los 1,2-dicarbonilos, y fue la primera de esta categoría utilizada ampliamente para el sondeo químico de ARN. Kethoxal provoca la modificación de la guanina, alterando específicamente el N1 y el grupo amino exocíclico (N2) simultáneamente por interacción covalente. [35]

El glioxal , el metilglioxal y el fenilglioxal, que llevan el resto clave 1,2-dicarbonilo, reaccionan con guaninas libres similares al cetoxal y pueden usarse para sondear bases de guanina desaparecidas en ARN estructurado. Debido a sus propiedades químicas, estos reactivos pueden penetrar fácilmente en las células y, por lo tanto, pueden usarse para analizar ARN en sus entornos celulares nativos. [34]

Sondeo LASER o NAz

El examen estructural activado por luz de ARN (LASER) utiliza luz ultravioleta para activar la nicotinoil azida (NAz), lo que genera un catión de nitrenio altamente reactivo en el agua, que reacciona con la guanosina y la adenosina de ARN accesibles al solvente en la posición C-8 a través de un Friedel- Reacción artesanal. El sondeo LÁSER se dirige tanto a residuos monocatenarios como bicatenarios siempre que sean accesibles a los disolventes. Debido a que el sondeo de radicales hidroxilo requiere radiación de sincrotrón para medir la accesibilidad del ARN al solvente in vivo , es difícil aplicar el sondeo de radicales hidroxilo a la huella de ARN en las células para muchos laboratorios. Por el contrario, la sonda LÁSER utiliza una lámpara UV de mano (20 W) para la excitación, es mucho más fácil aplicar la sonda LÁSER para in vivo.estudiar la accesibilidad a los solventes de ARN. Este método de sondeo químico es controlable por luz y prueba la accesibilidad del solvente de la nucleobase, que se ha demostrado que deja huellas de proteínas de unión de ARN dentro de las células. [36]

Palpación en línea

Ensayo de sondeo en línea de riboswitches de guanina que muestra cambios en la flexibilidad en respuesta a varios ligandos de nucleótidos [37]

El sondeo en línea no implica el tratamiento con ningún tipo de químico o reactivo para modificar las estructuras del ARN. Este tipo de ensayo de sondeo utiliza la escisión del ARN dependiente de la estructura; Las regiones monocatenarias son más flexibles e inestables y se degradarán con el tiempo. [38] El proceso de sondeo en línea se usa a menudo para determinar cambios en la estructura debido a la unión del ligando. La unión de un ligando puede dar como resultado diferentes patrones de escisión. El proceso de sondeo en línea implica la incubación de ARN estructurales o funcionales durante un largo período de tiempo. Este período puede ser de varios días, pero varía en cada experimento. Los productos incubados luego se procesan en un gel para visualizar las bandas. Este experimento se realiza a menudo usando dos condiciones diferentes: 1) con ligando y 2) en ausencia de ligando. [37] La escisión da como resultado longitudes de banda más cortas y es indicativo de áreas que no están apareadas, ya que las regiones con pares de bases tienden a ser menos sensibles a la escisión espontánea. [38] El sondeo en línea es un ensayo funcional que puede usarse para determinar cambios estructurales en el ARN en respuesta a la unión del ligando. Puede mostrar directamente el cambio en la flexibilidad y la unión de regiones de ARN en respuesta a un ligando, así como comparar esa respuesta con ligandos análogos. Este ensayo se usa comúnmente en estudios dinámicos, específicamente cuando se examinan riboswitches . [38]

Mapeo de interferencias análogas de nucleótidos (NAIM)

El mapeo de interferencia de análogos de nucleótidos (NAIM) es el proceso de utilizar análogos de nucleótidos, moléculas que son similares en algunos aspectos a los nucleótidos pero carecen de función, para determinar la importancia de un grupo funcional en cada ubicación de una molécula de ARN. [39] [40] El proceso de NAIM consiste en insertar un análogo de un solo nucleótido en un sitio único. Esto se puede hacer transcribiendo un ARN corto usando T7 ARN polimerasa , luego sintetizando un oligonucleótido corto que contenga el análogo en una posición específica, luego ligándolos juntos en la plantilla de ADN usando una ligasa. [39] Los análogos de nucleótidos se marcan con un fosforotioato, los miembros activos de la población de ARN se distinguen luego de los miembros inactivos, luego se elimina la marca de fosforotioato de los miembros inactivos y se identifican los sitios análogos usando electroforesis en gel y autorradiografía. [39] Esto indica un nucleótido funcionalmente importante, ya que la escisión del fosforotioato por el yodo da como resultado un ARN que se escinde en el sitio del inserto del análogo de nucleótido. Al ejecutar estas moléculas de ARN truncado en un gel, el nucleótido de interés se puede identificar frente a un experimento de secuenciación [40] Los resultados de la incorporación dirigida al sitio indican posiciones de importancia donde cuando se ejecutan en un gel, los ARN funcionales que tienen el análogo incorporado en esa posición tendrán una banda presente, pero si el análogo da como resultado una no funcionalidad, cuando las moléculas de ARN funcionales se ejecutan en un gel, no habrá una banda correspondiente a esa posición en el gel. [41] Este proceso se puede utilizar para evaluar un área completa, donde los análogos se colocan en ubicaciones específicas del sitio, que se diferencian por un solo nucleótido, luego, cuando los ARN funcionales se aíslan y se procesan en un gel, todas las áreas donde se producen bandas indican no nucleótidos esenciales, pero las áreas donde las bandas están ausentes del ARN funcional indican que la inserción de un análogo de nucleótido en esa posición hizo que la molécula de ARN se volviera no funcional [39]

Referencias

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