La RMN de ácido nucleico es el uso de espectroscopia de resonancia magnética nuclear para obtener información sobre la estructura y dinámica de las moléculas de ácido nucleico , como el ADN o el ARN . Es útil para moléculas de hasta 100 nucleótidos y, en 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopía de RMN. [1]
La RMN tiene ventajas sobre la cristalografía de rayos X , que es el otro método para la determinación de la estructura del ácido nucleico de alta resolución , ya que las moléculas se observan en su estado de solución natural en lugar de en una red cristalina que puede afectar las propiedades estructurales de la molécula. También es posible investigar la dinámica con RMN. Esto tiene el costo de estructuras un poco menos precisas y detalladas que la cristalografía. [2]
La RMN de ácido nucleico utiliza técnicas similares a las de la RMN de proteínas , pero tiene varias diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un porcentaje más pequeño de átomos de hidrógeno, que son los átomos que normalmente se observan en la RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". Los ácidos nucleicos también tienden a tener resonancias distribuidas en un rango más pequeño que las proteínas, lo que hace que los espectros sean potencialmente más saturados y difíciles de interpretar. [3]
metodos experimentales
Los métodos de RMN bidimensionales se utilizan casi siempre con ácidos nucleicos. Estos incluyen espectroscopía de correlación (COSY) y espectroscopía de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares mediante enlaces, y espectroscopía de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos cercanos entre sí en el espacio. Los tipos de RMN que se realizan normalmente con ácidos nucleicos son 1 H RMN , 13 C RMN , 15 N RMN y 31 P RMN . La 19F NMR también es útil si se incorporan nucleótidos no naturales tales como 2'-fluoro-2'-desoxiadenosina en la cadena de ácido nucleico, ya que los ácidos nucleicos naturales no contienen átomos de flúor. [2] [4]
El 1 H y el 31 P tienen una abundancia natural cercana al 100% , mientras que el 13 C y el 15 N tienen una abundancia natural baja. Para estos dos últimos núcleos, existe la capacidad de enriquecer isotópicamente los átomos deseados dentro de las moléculas, ya sea de manera uniforme o de una manera específica del sitio. Los nucleótidos enriquecidos uniformemente en 13 C y / o 15 N se pueden obtener mediante métodos bioquímicos, realizando una reacción en cadena de la polimerasa utilizando dNTP o NTP derivados de bacterias cultivadas en un entorno enriquecido isotópicamente. El enriquecimiento de isótopos específicos del sitio debe realizarse mediante la síntesis química del monómero de fosforamidita de nucleósido marcado y de la hebra completa ; sin embargo, estos son difíciles y costosos de sintetizar. [1] [5]
Debido a que los ácidos nucleicos tienen un número relativamente grande de protones que son intercambiables con solvente, la RMN de ácido nucleico generalmente no se realiza en solvente D 2 O como es común con otros tipos de RMN. Esto se debe a que el deuterio en el solvente reemplazaría a los protones intercambiables y extinguiría su señal. H 2 O se usa como solvente, y se usan otros métodos para eliminar la señal fuerte del solvente, como saturar la señal del solvente antes de la secuencia de pulso normal ("presaturación"), que funciona mejor a baja temperatura para evitar el intercambio de la saturación. protones de solvente con los protones de ácido nucleico; o excitar sólo las resonancias de interés ("excitación selectiva"), que tiene el efecto adicional, potencialmente no deseado, de distorsionar las amplitudes de los picos. [2]
Determinación de estructura
Los protones intercambiables y no intercambiables generalmente se asignan a sus picos específicos como dos grupos independientes. Para los protones intercambiables, que son en su mayor parte los protones involucrados en el emparejamiento de bases , NOESY se puede utilizar para encontrar correlaciones a través del espacio entre bases vecinas, lo que permite asignar una molécula dúplex completa a través de una caminata secuencial . Para los protones no intercambiables, muchos de los cuales se encuentran en el resto de azúcar del ácido nucleico, se usan COSY y TOCSY para identificar sistemas de núcleos acoplados, mientras que NOESY se usa nuevamente para correlacionar el azúcar con la base y cada base con su base vecina. Para los protones no intercambiables de ADN dúplex, los protones H6 / H8 en la base se correlacionan con sus contrapartes en bases vecinas y con el protón H1 'en el azúcar, lo que permite realizar una caminata secuencial. Para el ARN, las diferencias en la estructura química y la geometría de la hélice hacen que esta asignación sea técnicamente más difícil, pero aún posible. La metodología de caminata secuencial no es posible para estructuras de ácido nucleico de no doble hélice, ni para la forma Z-DNA , lo que dificulta la asignación de resonancias. [2] [3]
Los parámetros tomados del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , se pueden usar para determinar características estructurales locales como ángulos de enlace glicosídico, ángulos diedros (usando la ecuación de Karplus ) y conformaciones de fruncido de azúcar. La presencia o ausencia de resonancias de protones imino, o de acoplamiento entre átomos de 15 N a través de un enlace de hidrógeno, indica la presencia o ausencia de apareamiento de bases. Para estructuras a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otros supuestos o modelos estructurales, porque los errores se suman a medida que se atraviesa la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto y no se pliega hacia atrás. sí mismo. Sin embargo, se puede obtener información de orientación de largo alcance mediante experimentos de acoplamiento dipolar residual en un medio que impone un alineamiento débil en las moléculas de ácido nucleico. [1] [2]
Recientemente, se ha introducido la metodología de RMN de estado sólido para la determinación de la estructura de ácidos nucleicos. [6] El protocolo implica dos enfoques: etiquetado selectivo de ARN de tipo nucleótido y uso de experimentos de correlación heteronuclear.
La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar, como hélices dobladas , emparejamiento de bases que no son de Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil en el sondeo de la estructura de oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas, tales como tallo de bucles y pseudoknots . Las interacciones entre el ARN y los iones metálicos se pueden probar mediante una serie de métodos, incluida la observación de cambios en el cambio químico al unirse a los iones, la observación de la ampliación de la línea para las especies de iones paramagnéticos y la observación de los contactos NOE intermoleculares para las imitaciones organometálicas de los iones metálicos. La RMN también es útil para sondear la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, como proteínas o fármacos. Esto se puede hacer mediante el mapeo de desplazamiento químico, que consiste en ver qué resonancias se desplazan al unirse la otra molécula, o mediante experimentos de saturación cruzada en los que una de las moléculas de unión se satura selectivamente y, si está unida, la saturación se transfiere a la otra. molécula en el complejo. [1] [2]
Las propiedades dinámicas tales como equilibrios hebra dúplex de un solo y las tasas de unión de otras moléculas a dúplex también se pueden determinar por su efecto sobre la relajación spin-red tiempo T 1 , pero estos métodos no son sensibles a las tasas intermedias de 10 4 -10 8 s - 1 , que debe investigarse con otros métodos, como la RMN de estado sólido . La dinámica de las propiedades mecánicas de una doble hélice de ácido nucleico, como la flexión y la torsión, también se puede estudiar usando RMN. Los experimentos de RMN de gradiente de campo pulsado se pueden utilizar para medir las constantes de difusión . [1] [2] [7]
Historia
Los estudios de RMN de ácido nucleico se realizaron ya en 1971, [8] y se centraron en el uso de resonancias de imino protón de campo bajo para sondear interacciones de emparejamiento de bases. Estos primeros estudios se centraron en el ARNt porque estos ácidos nucleicos eran las únicas muestras disponibles en ese momento con un peso molecular lo suficientemente bajo como para que los anchos de línea espectrales de RMN fueran prácticos. El estudio se centró en los protones de campo bajo porque eran los únicos protones que podían observarse de forma fiable en solución acuosa utilizando los mejores espectrómetros disponibles en ese momento. Rápidamente se advirtió que los espectros de los imino protones de campo bajo proporcionaban pistas sobre la estructura terciaria del ARNt en solución. El primer espectro de RMN de un ADN de doble hélice se publicó en 1977 [9] utilizando una doble hélice sintética de 30 pares de bases. Para superar el ensanchamiento de línea severo en el ADN nativo, se preparó y estudió ADN natural completamente degradado para conocer la longitud de persistencia del ADN de doble hélice. [10] Al mismo tiempo, se estudiaron las partículas del núcleo del nucleosoma para conocer mejor la flexibilidad de la doble hélice. [11] El primer espectro de RMN informado para un ADN de secuencia nativa uniforme de bajo peso molecular, elaborado con enzimas de restricción , se informó en 1981. [12] Este trabajo también fue el primer informe de espectros de RMN de ácido nucleico obtenidos en campo alto. Los estudios bidimensionales de RMN comenzaron a publicarse en 1982 [13] y luego, con el advenimiento de la síntesis de oligonucleótidos y una instrumentación más sofisticada, se informaron muchos estudios estructurales detallados a partir de 1983 [14].
Referencias
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