P BAD (sistemáticamente araBp ) es un promotor que se encuentra en bacterias y especialmente como parte de plásmidos utilizados en estudios de laboratorio. El promotor forma parte del operón arabinosa cuyo nombre deriva de los genes que regula la transcripción de: araB , araA y araD . [1] [2] En E. coli , el promotor P BAD es adyacente al promotor P C (sistemáticamente araCp ), que transcribe araCgen en la dirección opuesta. araC codifica la proteína AraC , que regula la actividad de los promotores P BAD y P C. [3] [4] [5] La proteína CAP del receptor de AMP cíclico se une entre los promotores P BAD y P C , estimulando la transcripción de ambos cuando se une a cAMP. [6]
Regulación de P BAD
El inicio de la transcripción en el promotor P BAD se produce en presencia de concentraciones elevadas de arabinosa y bajas concentraciones de glucosa . [7] Tras la unión de la arabinosa a AraC, el brazo N-terminal de AraC se libera de su dominio de unión al ADN a través de un mecanismo de "interruptor de luz". [1] [2] Esto permite a AraC dimerizar y enlazar los operadores I 1 e I 2 . [3] El dímero de AraC-arabinosa en este sitio contribuye a la activación del promotor P BAD . [2] Además, CAP se une a dos sitios de unión de CAP corriente arriba de los operadores I 1 e I 2 y ayuda a activar el promotor P BAD . [6] Sin embargo, en presencia de altas concentraciones de arabinosa y de glucosa, los niveles bajos de cAMP evitan que CAP active el promotor P BAD . [7] Se plantea la hipótesis de que la activación del promotor P BAD por CAP y AraC está mediada por contactos entre el dominio C-terminal de la subunidad α de la ARN polimerasa y las proteínas CAP y AraC. [8]
Sin arabinosa, e independientemente de la concentración de glucosa, los promotores P BAD y P C son reprimidos por AraC. [2] [7] El brazo N-terminal de AraC interactúa con su dominio de unión al ADN, permitiendo que dos proteínas AraC se unan a los sitios operadores O 2 e I 1 . [1] El operador O 2 está situado dentro del gen araC . Un dímero AraC también se une al operador O 1 y reprime el promotor P C a través de un bucle de retroalimentación autorreguladora negativa . [2] Las dos proteínas AraC unidas se dimerizan y provocan un bucle del ADN. [3] [4] Los evita bucles de unión de CAP y ARN polimerasa, que normalmente activan la transcripción de tanto P BAD y P C .
Transcripción por P BAD | Alto contenido de arabinosa | Arabinosa baja |
Glucosa alta | Reprimido | Reprimido |
Glucosa baja | Activo | Reprimido |
El espacio entre los sitios de los operadores de O 2 e I 1 es crítico. La adición o eliminación de 5 pares de bases entre los sitios del operador O 2 e I 1 anula la represión del promotor P BAD mediada por AraC . [1] El requisito de espaciado surge de la naturaleza de doble hélice del ADN , en la que un giro completo de la hélice es de aproximadamente 10,5 nucleótidos . Por lo tanto, al agregar o eliminar 5 pares de bases entre los sitios del operador O 2 e I 1 , la hélice gira aproximadamente 180 grados. Esto invierte la dirección a la que se enfrenta el operador de O 2 cuando el ADN forma un bucle y evita la dimerización del AraC unido a O 2 con el araC unido I 1 . [1] [2]
El promotor P BAD en plásmidos de expresión
El promotor P BAD permite una regulación y un control estrictos de un gen diana in vivo . [7] Como se explicó anteriormente, el P BAD está regulado por la adición y ausencia de arabinosa . Como se probó, el promotor se puede reprimir más con niveles reducidos de AMPc mediante la adición de glucosa. [7] Se han construido y probado vectores plasmídicos con un marcador seleccionable (Cm R en este caso), origen de replicación , araC y operones, sitio de clonación múltiple y promotor P BAD . Los estudios muestran que los vectores están altamente expresados y pueden usarse, en combinación con alelos cromosómicos nulos , para estudiar la pérdida de función de genes esenciales. [7]
Referencias
- ^ a b c d e Schleif R. Proteína AraC, regulación del operón L-arabinosa en Escherichia coli y el mecanismo de interruptor de luz de la acción AraC. FEMS Microbiol Rev (2010) 1–18.
- ^ a b c d e f Schleif R. Proteína AraC: una relación de amor-odio. Bioensays 2003, 25: 274-282.
- ^ a b c Reed WL, Schleif RF. Mutaciones hemipléjicas en la proteína AraC. J. Mol. Biol. (1999) 294, 417-425.
- ^ a b Lobell RB, Schleif RF. Bucle y desbloqueo de ADN por la proteína AraC. Ciencias. 26 de octubre de 1990; 250 (4980): 528-32.
- ^ Soisson SM, MacDougall-Shackleton B, Schleif R, Wolberger C. Base estructural para la oligomerización regulada por ligando de AraC. Ciencias. 18 de abril de 1997; 276 (5311): 421-5.
- ^ a b Dunn TM, Schleif R. Análisis de deleción de los promotores de PC y PBAD de Escherichia coli ara. J.Mol. Biol. (1984) 180, 201-204.
- ^ a b c d e f Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J. Regulación estricta, modulación y expresión de alto nivel por vectores que contienen el promotor de arabinosa PBAD. J Bacteriol. Julio de 1995; 177 (14): 4121–4130.
- ^ Johnson CM, Schleif RF. Acción cooperativa de la proteína activadora de catabolitos y AraC in vitro en el promotor araFGH. J Bacteriol. Abril de 2000; 182 (7).