Una micromatriz de péptidos (también conocida comúnmente como chip de péptido o micromatriz de epítopo de péptido) es una colección de péptidos que se muestran en una superficie sólida, generalmente un chip de vidrio o plástico. Los científicos de biología, medicina y farmacología utilizan chips de péptidos para estudiar las propiedades de unión y la funcionalidad y la cinética de las interacciones proteína-proteína en general. En la investigación básica, los microarrays de péptidos se utilizan a menudo para perfilar una enzima (como quinasa , fosfatasa , proteasa , acetiltransferasa , histona desacetilasa, etc.), para mapear un epítopo de anticuerpo.o para encontrar residuos clave para la unión a proteínas. Las aplicaciones prácticas son el descubrimiento de seromarcadores , la elaboración de perfiles de las respuestas inmunitarias humorales cambiantes de pacientes individuales durante la progresión de la enfermedad, el seguimiento de intervenciones terapéuticas, la estratificación de pacientes y el desarrollo de herramientas de diagnóstico y vacunas .
Otros nombres | Chip de péptidos, matriz de péptidos |
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Usos | Estudiar las propiedades de unión, la especificidad y la funcionalidad y la cinética de las interacciones proteína-péptido o proteína-proteína. |
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Principio
El principio de ensayo de las micromatrices de péptidos es similar a un protocolo ELISA . Los péptidos (hasta decenas de miles en varias copias) están vinculados a la superficie de un chip de vidrio, generalmente del tamaño y la forma de un portaobjetos de microscopio. Este chip de péptido se puede incubar directamente con una variedad de muestras biológicas diferentes como enzimas o anticuerpos purificados , sueros de pacientes o animales , lisados celulares y luego detectarse a través de una forma dependiente de la etiqueta, por ejemplo, mediante un anticuerpo primario que se dirige a la proteína unida. o sustratos modificados. Después de varios pasos de lavado, se aplica un anticuerpo secundario con la especificidad necesaria (por ejemplo, anti IgG humano / ratón o anti fosfotirosina o anti myc). Por lo general, el anticuerpo secundario se marca con una etiqueta de fluorescencia que puede detectarse mediante un escáner de fluorescencia. [2] Otros métodos de detección dependientes de la etiqueta incluyen quimioluminiscencia, colorimétrico o autorradiografía.
Los ensayos dependientes de la etiqueta son rápidos y cómodos de realizar, pero corren el riesgo de dar lugar a resultados falsos positivos y negativos. [3] Más recientemente, la detección sin etiquetas, incluida la espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR), la espectrometría de masas (MS) y muchos otros biosensores ópticos [4] [5] [6] [7] se han empleado para medir una amplia gama de actividades enzimáticas. [8]
Los microarrays de péptidos muestran varias ventajas sobre los microarrays de proteínas :
- Facilidad y costo de síntesis
- Estabilidad de almacenamiento extendida
- Detección de eventos de unión a nivel de epítopo, lo que permite el estudio de, por ejemplo, la propagación del epítopo
- Diseño flexible para secuencias de péptidos (es decir, modificaciones postraduccionales, diversidad de secuencias, aminoácidos no naturales ...) y químicas de inmovilización
- Mayor reproducibilidad de lote a lote
Producción de una micromatriz de péptidos
Una micromatriz de péptidos es un portaobjetos plano con péptidos colocados sobre él o ensamblados directamente en la superficie mediante síntesis in situ. Mientras que los péptidos manchados pueden someterse a controles de calidad que incluyen análisis de espectrómetro de masas y normalización de la concentración antes del manchado y resultan de un solo lote sintético, los péptidos sintetizados directamente en la superficie pueden sufrir variaciones de lote a lote y opciones de control de calidad limitadas. Sin embargo, la síntesis de péptidos en chip permite la síntesis paralela de decenas de miles de péptidos proporcionando bibliotecas de péptidos más grandes emparejadas con costos de síntesis más bajos. [9] Idealmente, los péptidos se unen covalentemente a través de un enlace quimioselectivo que conduce a péptidos con la misma orientación para el perfil de interacción. Algunos procedimientos alternativos describen la unión covalente inespecífica y la inmovilización adhesiva.
Sin embargo, se pueden utilizar métodos litográficos para superar el problema del número excesivo de ciclos de acoplamiento. Se ha descrito la síntesis combinatoria de matrices de péptidos en un microchip mediante impresión láser, [9] [10] donde se utiliza una impresora láser de color modificada en combinación con la química de síntesis de péptidos en fase sólida convencional . [11] Los aminoácidos se inmovilizan dentro de las partículas de tóner y los péptidos se imprimen en la superficie del chip en capas combinatorias consecutivas. La fusión del tóner al comienzo de la reacción de acoplamiento asegura que el suministro de los aminoácidos y la reacción de acoplamiento se puedan realizar de forma independiente. Otra ventaja de este método es que cada aminoácido se puede producir y purificar por separado, seguido de incrustarlo en las partículas de tóner, lo que permite un almacenamiento a largo plazo.
Aplicaciones de los microarrays de péptidos
Las micromatrices de péptidos se pueden usar para estudiar diferentes tipos de interacciones proteína-proteína, especialmente aquellas que involucran subestructuras proteicas modulares llamadas módulos de reconocimiento de péptidos o, más comúnmente, dominios de interacción de proteínas. La razón de esto es que tales subestructuras de proteínas reconocen motivos lineales cortos a menudo expuestos en regiones nativamente no estructuradas del socio de unión, de modo que la interacción puede modelarse in vitro por péptidos como sondas y el módulo de reconocimiento de péptidos como analito. La mayoría de las publicaciones se pueden encontrar en el contexto de la monitorización inmunitaria y el perfil enzimático.
Inmunología
- Mapeo de regiones inmunodominantes en antígenos o proteomas completos [12] [13] [14] [15]
- Descubrimiento de seromarcadores [16]
- Seguimiento de los ensayos clínicos [17]
- Perfiles de firmas de anticuerpos [18] [19] y mapeo de epítopos
- Encontrar anticuerpos neutralizantes [20]
Perfilado de enzimas
- Identificación de sustratos para enzimas huérfanas [21]
- Optimización de sustratos enzimáticos conocidos [22]
- Aclaración de las vías de transducción de señales [23]
- Detección de actividades enzimáticas contaminantes
- Secuencia de consenso y determinación de residuos clave [24]
- Identificación de sitios para interacciones proteína-proteína dentro de un complejo [25]
Análisis y evaluación de resultados
El análisis de datos y la evaluación de resultados es la parte más importante de cada experimento de microarrays. [26] Después de escanear las diapositivas de microarrays, el escáner graba una imagen numérica de 20 bits, 16 bits u 8 bits en formato de archivo de imagen etiquetada (* .tif). La imagen .tif permite la interpretación y cuantificación de cada punto fluorescente en el portaobjetos de microarrays escaneados. Estos datos cuantitativos son la base para realizar análisis estadísticos sobre eventos de unión medidos o modificaciones de péptidos en el portaobjetos de microarrays. Para la evaluación e interpretación de las señales detectadas, se debe realizar una asignación de la mancha peptídica (visible en la imagen) y la secuencia peptídica correspondiente. Los datos para la asignación generalmente se guardan en el archivo GenePix Array List (.gal) y se suministran junto con la micromatriz de péptidos. El archivo .gal (un archivo de texto separado por tabulaciones) se puede abrir usando módulos de software de cuantificación de microarrays o procesarse con un editor de texto (por ejemplo, un bloc de notas) o Microsoft Excel. Este archivo "gal" lo proporciona con mayor frecuencia el fabricante de microarrays y se genera mediante archivos txt de entrada y software de seguimiento integrado en los robots que fabrican las microarrays.
Referencias
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