Horquilla polipurina reversa-Hoogsteen
Las horquillas de Hoogsteen inversas de polipurina ( PPRH ) son oligonucleótidos no modificados que contienen dos dominios de polipurina, en forma de repetición especular, unidos por un tramo de pentatimidina que forma moléculas de bucle de ADN de doble cadena. Los dos dominios de polipurina interactúan mediante enlaces Hoogsteen inversos intramoleculares que permiten la formación de esta estructura de horquilla específica.
Los PPRH pueden unirse a tramos de polipirimidina en ADN de cadena simple o doble mediante enlaces de Watson y Crick que establecen estructuras de ADN de cadena triple . La formación de triplexes de PPRH tiene lugar a pH fisiológico. Los PPRH provocan un desplazamiento de la hebra. [1] de la secuencia de homopurina del dsDNA objetivo, abriendo las dos hebras del ADN. Hay dos tipos de PPRH: i) Plantilla-PPRH [2] que se unen a la hebra plantilla de ADN, inhibiendo la transcripción; y ii) PPRH codificantes [3] que se unen a la hebra codificante del empalme que altera el ADN. Ambos tipos de PPRH disminuyen la expresión génica. Los PPRH presentan alta estabilidad en suero y células y muestran falta de inmunogenicidad no activando la respuesta inflamatoria innata. [4]Los PPRH no tienen efectos secundarios y no muestran hepatotoxicidad ni nefrotoxicidad. [5]
Los PPRH podrían usarse como herramientas de silenciamiento génico [6] actuando por mecanismos diferentes a los oligonucleótidos formadores de triplex (TFO), oligonucleótidos antisentido o siRNA . Al unirse a sus objetivos, los PPRH pueden disminuir los niveles de ARNm y proteína de los genes seleccionados. Su acción ha sido demostrada in vitro para una serie de genes implicados en el metabolismo ( DHFR ), la proliferación ( mTOR ), la topología del ADN ( TOP1 ), la vida útil y la senescencia ( telomerasa ), la apoptosis ( survivina , BCL2 ), los factores de transcripción ( MYC ), protooncogenes ( MDM2), [7] estrés de replicación ( WEE1 , CHK1 ) [8] y timidilato sintasa (TYMS) [9] como parte de una estrategia de terapia génica contra el cáncer. Su prueba preclínica de principio se ha probado in vivo utilizando el gen antiapoptótico de la survivina. [10] Los PPRH también se han aplicado como herramientas en inmunoterapia contra el cáncer al silenciar CD47 en células de cáncer de mama MCF7 y SIRPα en macrófagos, [11] y la vía PD-1/PD-L1 en células tumorales humanas. [12] [13]
Los PPRH se pueden diseñar para prácticamente cualquier gen en el genoma buscando tramos de polipirimidina en la secuencia del gen deseado. Las longitudes óptimas para cada dominio de los PPRH se encuentran entre 20 y 30 nucleótidos. La longitud total de una PPRH típica es de 55 nucleótidos considerando dos dominios de 25 bases más 5T para el bucle de enlace. Si se encuentran interrupciones de purina (hasta tres) dentro del objetivo de polipirimidina, la afinidad más alta de unión de PPRH se logra colocando en la horquilla la base complementaria (una pirimidina) delante de las purinas [14] (PPRH de tipo salvaje).
Un desarrollo adicional consiste en extender el flanco 5' de la PPRH con una secuencia complementaria a la hebra de polipurina desplazada del dsDNA objetivo que estabiliza el desplazamiento de la hebra, produciendo unión y funcionalidad adicionales. [14]
Un sitio de ADN diana triplex (TTS), un tramo de ADN compuesto de polipurinas, es capaz de formar una estructura de triple hélice (tríplex) en el ADN genómico. Herramientas WEB integradoras para la identificación y el análisis de las secuencias de ADN diana de la formación triplex, incluidas las secuencias de PPRH, asociadas con genes y elementos reguladores (p. ej., sitios de unión de factores de transcripción, repeticiones, motivos de cuádruple G, SNP y elementos de ADN reguladores que no codifican proteínas ) en el genoma humano están disponibles públicamente (ver Enlaces externos). [15] [16]
