Survivina , también llamada inhibidor baculoviral de la repetición de apoptosis que contiene 5 o BIRC5 , es una proteína que, en los seres humanos, está codificada por el gen BIRC5 . [5] [6]
BIRC5 | |||||||||||||||||||||||||
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Identificadores | |||||||||||||||||||||||||
Alias | BIRC5 , API4, EPR-1, repetición IAP baculoviral que contiene 5 | ||||||||||||||||||||||||
Identificaciones externas | OMIM : 603352 MGI : 1203517 HomoloGene : 37450 GeneCards : BIRC5 | ||||||||||||||||||||||||
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Ortólogos | |||||||||||||||||||||||||
Especies | Humano | Ratón | |||||||||||||||||||||||
Entrez |
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Ensembl |
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Ubicación (UCSC) | Crónicas 17: 78,21 - 78,23 Mb | Crónicas 11: 117,85 - 117,86 Mb | |||||||||||||||||||||||
Búsqueda en PubMed | [3] | [4] | |||||||||||||||||||||||
Wikidata | |||||||||||||||||||||||||
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Survivin es un miembro de la familia de los inhibidores de la apoptosis (IAP). La proteína survivina funciona para inhibir la activación de la caspasa , lo que conduce a una regulación negativa de la apoptosis o muerte celular programada . Esto se ha demostrado por la interrupción de las vías de inducción de survivina que conducen a un aumento de la apoptosis y una disminución del crecimiento tumoral. La proteína survivina se expresa en gran medida en la mayoría de los tumores humanos y tejido fetal, pero está completamente ausente en las células diferenciadas terminalmente. [7] Estos datos sugieren que la survivina podría proporcionar un nuevo objetivo para la terapia del cáncer que discriminaría entre células transformadas y normales. La expresión de survivina también está altamente regulada por el ciclo celular y solo se expresa en la fase G2-M. Se sabe que la Survivina se localiza en el huso mitótico por interacción con la tubulina durante la mitosis y puede contribuir a regular la mitosis. Los mecanismos moleculares de la regulación de la survivina aún no se comprenden bien, pero la regulación de la survivina parece estar relacionada con la proteína p53 . También es un gen diana directo de la vía Wnt y está regulado positivamente por la beta-catenina . [8]
Familia IAP de proteínas anti-apoptóticas
Survivin es un miembro de la familia IAP de proteínas antiapoptóticas . Se muestra que se conserva en función a lo largo de la evolución, ya que se encuentran homólogos de la proteína tanto en vertebrados como en invertebrados . [9] Los primeros miembros de los IAP identificados fueron los IAP de baculovirus , Cp-IAP y Op-IAP, que se unen e inhiben las caspasas como un mecanismo que contribuye a su eficaz ciclo de infección y replicación en el huésped. [9] Más tarde, se descubrieron cinco IAP humanas más que incluían XIAP , c-IAP1 , C-IAP2 , NAIP y survivina. Survivina, como las demás, se descubrió por su homología estructural con la familia de proteínas IAP en el linfoma de células B humano . Se ha demostrado que las IAP humanas, XIAP, c-IAP1, C-IAP2 se unen a caspasa-3 y -7 , que son las caspasas efectoras en la vía de señalización de la apoptosis. [9] Sin embargo, no se sabe con absoluta certeza cómo los IAP inhiben la apoptosis mecánicamente a nivel molecular.
Una característica común que está presente en todos los IAP en presencia de un BIR (Baculovirus IAP Repeat, un motivo de ~ 70 aminoácidos) en una a tres copias. Tamm et al. que eliminar BIR2 de XIAP fue suficiente para causar una pérdida de función en términos de la capacidad de XIAP para inhibir las caspasas. Esto da la implicación de que está dentro de estos motivos BIR que contiene la función antiapoptótica de estos IAP. El dominio BIR de Survivin muestra una secuencia similar en comparación con la de los dominios BIR de XIAP. [9]
Isoformas
El único gen de survivina puede dar lugar a cuatro transcripciones diferentes empalmadas alternativamente: [10]
- Survivina , que tiene una estructura de tres intrones y cuatro exones tanto en el ratón como en el ser humano.
- Survivina-2B , que tiene una inserción de un exón 2 alternativo.
- Survivin-Delta-Ex-3 , al que se le ha eliminado el exón 3. La eliminación del exón 3 da como resultado un cambio de marco que genera un extremo carboxilo único con una nueva función. Esta nueva función puede involucrar una señal de localización nuclear. Además, también se genera una señal de localización mitocondrial.
- Survivina-3B , que tiene una inserción de un exón 3 alternativo.
Estructura
Una característica estructural común a todas las proteínas de la familia IAP es que todas contienen al menos un dominio de repetición IAP baculoviral ( BIR ) caracterizado por un motivo Cys / His coordinado con zinc conservado en la mitad N-terminal de la proteína. [11] [12]
Survivin se distingue de otros miembros de la familia IAP en que tiene solo un dominio BIR. [11] [12] Los ratones y el dominio BIR humano de la survivina son muy similares estructuralmente, excepto por dos diferencias que pueden afectar la variabilidad de la función. La survivina humana también contiene una hélice C-terminal alargada que comprende 42 aminoácidos. [11] [12] Survivin tiene un tamaño de 16,5 kDa y es el miembro más pequeño de la familia IAP. [11] [12] La cristalografía de rayos X ha mostrado dos moléculas de seres humanos supervivientes que se unen para formar un dímero en forma de pajarita a través de una interfaz hidrófoba. [11] [12] Esta interfaz incluye los residuos N-terminales 6-10 justo antes de la región del dominio BIR y la región de 10 residuos que conecta el dominio BIR a la hélice C-terminal. [11] [12] La integridad estructural de la estructura cristalina determinada de la survivina es bastante confiable, ya que se utilizaron condiciones fisiológicas para obtener las imágenes.
Función
Apoptosis
La apoptosis , el proceso de muerte celular programada, involucra vías de señalización complejas y cascadas de eventos moleculares. Este proceso es necesario para el correcto desarrollo durante el crecimiento embrionario y fetal donde hay destrucción y reconstrucción de estructuras celulares. En los organismos adultos, la apoptosis es necesaria para mantener el tejido diferenciado al lograr el equilibrio entre la proliferación y la muerte celular. Se sabe que las proteasas intracelulares llamadas caspasas degradan el contenido celular de la célula mediante proteólisis tras la activación de la vía de la muerte.
Las células de mamíferos tienen dos vías principales que conducen a la apoptosis.
1. Vía extrínseca : iniciada por ligandos extrínsecos que se unen a receptores de muerte en la superficie de la célula. Un ejemplo de esto es la unión del factor de necrosis tumoral alfa ( TNF-alfa ) al receptor de TNF-alfa . Un ejemplo de un receptor de TNF es Fas ( CD95 ), que recluta caspasas activadoras como la caspasa-8 al unirse al TNF en la superficie celular. La activación de las caspasas iniciadoras inicia una cascada de eventos aguas abajo que da como resultado la inducción de caspasas efectoras que funcionan en la apoptosis. [9] [13]
2. Vía intrínseca : esta vía se inicia por estímulos intracelulares o ambientales. Se centra en detectar el funcionamiento inadecuado de las mitocondrias en la célula y, como resultado, activa las vías de señalización para suicidarse. La permeabilidad de la membrana de las mitocondrias aumenta y se liberan proteínas particulares en el citoplasma que facilitan la activación de las caspasas iniciadoras. La proteína particular liberada de las mitocondrias es el citocromo c . El citocromo c luego se une a Apaf-1 en el citosol y da como resultado la activación del iniciador caspasa-9. La activación de las caspasas iniciadoras inicia una cascada de eventos aguas abajo que da como resultado la inducción de caspasas efectoras que funcionan en la apoptosis. [9] [13]
Una familia de proteínas llamadas IAP juega un papel en la regulación de la muerte celular al inhibir el proceso. Las IAP, como la survivina, inhiben la apoptosis al unirse físicamente e inhibir la función apropiada de la caspasa. [9] La función de las IAP se conserva evolutivamente, ya que se ha demostrado que los homólogos de Drosophila de las IAP son esenciales para la supervivencia celular. [9]
Los IAP han sido implicados en estudios para tener un efecto regulador sobre la división celular. Las células de levadura con knock-outs de ciertos genes IAP no mostraron problemas asociados con la muerte celular, pero mostraron defectos en la mitosis caracterizados por segregación cromosómica inadecuada o citocinesis fallida. [9]
La supresión de IAP particulares no parece tener un efecto profundo en la vía de muerte celular, ya que existe una redundancia de función por parte de los muchos IAP que existen en una célula. [9] Sin embargo, se les ha implicado que desempeñan un papel en el mantenimiento de un entorno antiapoptótico intracelular. Cambiar la expresión de IAP particulares ha mostrado un aumento en la inducción de muerte celular espontánea o una mayor sensibilidad a los estímulos de muerte. [9]
Mecanismo de acción
Inhibición de la apoptosis inducida por Bax y Fas
Tamm y col. han demostrado que la survivina inhibe las vías apoptóticas inducidas por Fas y Bax . [9] El experimento implicó la transfección de células HEK 293 con un plásmido que codifica Bax, lo que resultó en un aumento de la apoptosis (~ 7 veces) según lo medido por tinción DAPI . [9] Luego contransfectaron las células 293 con plásmido que codifica Bax y plásmidos que codifican survivina. Observaron que las células transfectadas junto con la survivina mostraban una disminución significativa de la apoptosis (~ 3 veces). También se mostró un resultado similar para las células transfectadas con el plásmido que sobreexpresa Fas. Se realizaron inmunotransferencias y se confirmó que la survivina no inhibe por el mecanismo que impide que la proteína Bax o Fas se convierta en proteínas completamente funcionales. [9] Por lo tanto, la survivina debería actuar en algún lugar aguas abajo de la vía de señalización Bax o Fas para inhibir la apoptosis a través de estas vías. [9]
Interacción con caspasa-3 y -7
En esta parte del experimento, Tamm et al. transfectaron células 293 con survivina y las lisaron para obtener lisado celular. Los lisados se incubaron con diferentes formas de caspasa y la survivina se inmunopercipitó con el anticuerpo anti-survivina. La idea detrás de esto es que, si la survivina se une físicamente con la caspasa con la que se incuba, se coprecipitará junto con la survivina mientras que todo lo demás en el lisado se elimina por lavado. Los inmunoprecipitados se procesaron luego en SDS-PAGE y luego se inmunotransfirieron para la detección de la caspasa deseada. Si se detectaba la caspasa de interés, significaba que estaba unida a la survivina en el paso de inmunoprecipitación, lo que implica que la survivina y la caspasa particular se habían unido de antemano. Caspasa activa-3 y -7 coinmunoprecipitada con survivina. Las formas inactivas de caspasa-3 y -7 no se unieron a la survivina. [9] Survivin tampoco se une a la caspasa-8 activa. [9] La caspasa-3 y -7 son proteasas efectoras, mientras que la caspasa-8 es una caspasa iniciadora que se encuentra más corriente arriba en la vía apoptótica. [9] Estos resultados demuestran la capacidad de survivin para unirse con caspasas particulares in vitro , pero no necesariamente se traducen en condiciones fisiológicas reales. Más tarde, un estudio de 2001 confirmó que la survivina humana se une estrechamente a la caspasa-3 y -7 cuando se expresa en E. coli . [14]
Tamm et al. Proporcionaron más pruebas para apoyar la idea de que la survivina bloquea la apoptosis inhibiendo directamente las caspasas . Se transfectaron células 293 con plásmido que codifica caspasa-3 o -7 sobreexpuesto y con survivina. Demostraron que la survivina inhibía el procesamiento de estas dos caspasas en sus formas activas. Aunque se ha demostrado que la survivina, como se mencionó anteriormente, se une solo a las formas activas de estas caspasas, es probable que la survivina inhiba las formas activas de las caspasas que resultan de la escisión y activación de más de sus propias formas. Por tanto, la survivina actúa posiblemente impidiendo que se produzca tal cascada de amplificación de activación y escisión, lo que da como resultado una apoptosis disminuida. [9]
De manera similar, al observar la vía mitocondrial de la apoptosis, el citocromo c se expresó de forma transitoria en las células 293 para observar los efectos inhibidores que tenía la survivina en esta vía. Aunque los detalles no están aquí, se demostró que la survivina también inhibe la activación de caspasas inducida por el citocromo cy la caspasa-8. [9]
Regulación de la citocinesis
Si bien se desconoce el mecanismo por el cual la survivina puede regular la mitosis celular y la citocinesis , las observaciones realizadas sobre su localización durante la mitosis sugieren fuertemente que está involucrada de alguna manera en el proceso citocinético.
Se colocaron células Daoy proliferantes en un cubreobjetos de vidrio, se fijaron y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para survivina y alfa-tubulina. Se usó inmunofluorescencia usando microscopía confocal para observar la localización de la survivina y la tubulina durante el ciclo celular para buscar cualquier patrón de expresión de la survivina. Survivina estuvo ausente en la interfase , pero presente en la fase G2 - M . [10]
Durante las diferentes etapas de la mitosis, se pudo ver que la survivina sigue un cierto patrón de localización. En la profase y la metafase , la survivina tiene una ubicación principalmente nuclear. [10] Durante la profase, a medida que la cromatina se condensa para que sea visible bajo el microscopio, la survivina comienza a moverse hacia los centrómeros. [10] En la prometafase, cuando la membrana nuclear se disocia y los microtúbulos del huso cruzan la región nuclear, la survivina permanece en los centrómeros . [10] En la metafase, cuando los cromosomas se alinean en la placa del medio y son tirados con alta tensión hacia cualquiera de los polos por las uniones del cinetocoro, la survivina se asocia con los cinetocoros. [10] En la anafase, cuando ocurre la separación de las cromátidas, los microtúbulos del cinetocoro se acortan a medida que los cromosomas se mueven hacia los polos del huso y la survivina también se mueve hacia la placa media. [10] Survivina, por tanto, se acumula en la placa media en la telofase. [10] Finalmente, la supervivencia se localiza en la parte media del cuerpo en el surco de división. [10]
Interacción y localización a las mitocondrias.
Se ha demostrado que la survivina puede heterodimerizar individualmente con las dos variantes de corte y empalme Survivina-2B y survivina-deltaEx3. [10] La evidencia de la heterodimerización de las variantes de empalme de survivina con survivina se mostró con experimentos de co-inmunoprecipitación después de la cotransfección con las respectivas variantes de survivina con survivina. Para determinar la localización de la survivina-2B y la survivina-deltaEx3 expresadas exógenamente, se hicieron construcciones de fusión de las proteínas con GFP y HcRed respectivamente y se transfectaron células Daoy con las construcciones de plásmido. La supervivencia también se marcó con una proteína fluorescente. La fusión de las variantes de survivina con las moléculas fluorescentes permite una detección sencilla de la ubicación celular mediante microscopía de fluorescencia. Survivina-2B por sí misma, localizada tanto en el compartimento nuclear como en el citoplasmático, mientras que la survivina-deltaEx3 se localiza solo en el núcleo. [10] Sin embargo, la localización de las tres variantes (survivina, Survivina-2B y survivina-deltaEx3) difieren cuando se cotransfectan juntas en lugar de individualmente. [10]
Para ver qué compartimentos subcelulares contenían los complejos de variantes de empalme de survivina, se emplearon marcadores de anticuerpos fluorescentes para diferentes orgánulos en la célula. La suposición es que, bajo microscopía de fluorescencia, si el complejo de survivina particular está ubicado en ese compartimento celular particular, se observaría una superposición de la fluorescencia emitida por el complejo de survivina marcado y también el compartimento marcado. Se usa fluorescencia de diferente color para distinguir el compartimento de la survivina.
- Retículo endoplásmico y liosomas : sin colocalización
- Mitocondrias y golgi : tanto survivina / survivina-2B como survivina / survivina-deltaEx3 colocalizan
Para verificar estas observaciones, fraccionaron los compartimentos subcelulares y realizaron análisis de transferencia Western para decir definitivamente que los complejos de survivina de hecho se localizaron en estos compartimentos.
Papel en el cáncer
Expresión en diferentes carcinomas
Se sabe que la survivina se expresa durante el desarrollo fetal y en la mayoría de los tipos de células tumorales, pero rara vez está presente en células adultas normales no malignas. [15] Tamm y col. mostró que la survivina se expresaba en las 60 diferentes líneas de tumores humanos utilizadas en el programa de detección de fármacos contra el cáncer del Instituto Nacional del Cáncer , con los niveles más altos de expresión en las líneas de cáncer de mama y pulmón y los niveles más bajos en los cánceres renales . [9] Conocer los niveles de expresión relativa de survivina en diferentes tipos de tumores puede resultar útil, ya que la terapia relacionada con la survivina puede administrarse según el nivel de expresión y la dependencia del tipo de tumor de la survivina para la resistencia a la apoptosis.
Como oncogén
La survivina puede considerarse un oncogén, ya que su sobreexpresión aberrante en la mayoría de las células cancerosas contribuye a su resistencia a los estímulos apoptóticos y las terapias quimioterapéuticas, contribuyendo así a su supervivencia en curso.
Inestabilidad genómica
Se ha descubierto que la mayoría de los cánceres humanos tienen ganancias y pérdidas de cromosomas que pueden deberse a la inestabilidad cromosómica (NIC). Una de las causas de la NIC es la inactivación de los genes que controlan la segregación adecuada de las cromátidas hermanas durante la mitosis. Para comprender mejor la función de la survivina en la regulación mitótica, los científicos han investigado el área de la inestabilidad genómica. Se sabe que la survivina se asocia con los microtúbulos del huso mitótico al comienzo de la mitosis. [dieciséis]
Se ha demostrado en la bibliografía que la eliminación de la survivina en las células cancerosas interrumpirá la formación de microtúbulos y dará como resultado poliploidía y apoptosis masiva. [16] También se ha demostrado que las células con depleción de survivina salen de la mitosis sin lograr una alineación cromosómica adecuada y luego reforman los núcleos tetraploides individuales. [16] Más evidencia también sugiere que la survivina es necesaria para sostener la detención mitótica al encontrarse con problemas de mitosis. [16] La evidencia mencionada anteriormente implica que la survivina juega un papel regulador importante tanto en la progresión de la mitosis como en el mantenimiento de la detención mitótica. Esto parece extraño, ya que se sabe que la survivina está altamente regulada al alza en la mayoría de las células cancerosas (que generalmente contienen características de inestabilidad cromosómica), y su función es la que promueve la regulación adecuada de la mitosis.
Regulación por p53
p53 inhibe la expresión de survivina a nivel transcripcional
Se ha demostrado que p53 de tipo salvaje reprime la expresión de survivina a nivel de ARNm. [17] Utilizando un vector de adenovirus para p53 de tipo salvaje, se transfectó la línea celular de cáncer de ovario humano 2774qw1 (que expresa p53 mutante). Los niveles de ARNm de survivina se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real ( RT-PCR ) y mostraron una regulación descendente dependiente del tiempo de los niveles de ARNm de survivina cuando las células se infectaron con p53 de tipo salvaje. [17] Se observó una disminución de 3,6 veces en el nivel de ARNm de survivina 16 horas después del inicio de la infección y disminuyó 6,7 veces 24 horas después de la infección. [17] Los resultados de la transferencia Western muestran que, de hecho, el p53 del vector adenoviral se expresaba en las células utilizando un anticuerpo específico para p53. La expresión de los niveles de p53 indicativos de su papel en la represión de survivina muestra que p53 comenzó a expresarse 6 horas después de la infección y tuvo su nivel más alto a las 16-24 horas. [17] Para confirmar aún más que el p53 endógeno de tipo salvaje realmente está causando la represión de la expresión del gen de survivina, los autores indujeron A549 (línea celular de cáncer de pulmón humano con p53 de tipo silvestre) y T47D (línea celular de cáncer de mama humano con p53 mutante) células con el agente adriamicina que daña el ADN para desencadenar la respuesta apoptótica de p53 fisiológica en estas células cancerosas y comparar los niveles de survivina medidos con las mismas células sin inducción de daño del ADN. La línea A549, que intrínsecamente tiene p53 de tipo salvaje funcional, mostró una reducción significativa en los niveles de survivina en comparación con las células no inducidas. [17] Este mismo efecto no se observó en las células T47D que portan p53 mutante inactivo. [17]
La función normal de P53 es regular los genes que controlan la apoptosis. Dado que la survivina es un inhibidor conocido de la apoptosis, se puede implicar que la represión de la survivina por p53 es un mecanismo por el cual las células pueden sufrir apoptosis tras la inducción por estímulos o señales apoptóticas. Cuando la survivina se sobreexpresa en las líneas celulares mencionadas en el párrafo anterior, la respuesta apoptótica del agente adriamicina que daña el ADN disminuyó de una manera dependiente de la dosis. [17] Esto sugiere que la regulación a la baja de la survivina por p53 es importante para que la vía apoptótica mediada por p53 dé como resultado con éxito la apoptosis. Se sabe que una característica definitoria de la mayoría de los tumores es la sobreexpresión de survivina y la pérdida completa de p53 de tipo salvaje. [17] La prueba presentada por Mirza et al. muestra que existe un vínculo entre survivin y p53 que posiblemente pueda explicar un evento crítico que contribuye a la progresión del cáncer.
p53 supresión de la expresión de survivina
Para ver si la reexpresión de p53 en células cancerosas (que han perdido la expresión de p53) tiene el efecto supresor sobre el promotor del gen de survivina, se elaboró una construcción informadora de luciferasa. El promotor de survivina aislado se colocó cadena arriba del gen indicador de luciferasa. En un ensayo de indicador de luciferasa, si el promotor está activo, el gen de la luciferasa se transcribe y se traduce en un producto que emite luz que se puede medir cuantitativamente y, por tanto, representa la actividad del promotor. Esta construcción se transfectó en células cancerosas que tenían p53 de tipo salvaje o mutante. Se midió una alta actividad de luciferasa en las células con p53 mutante y se midieron niveles de luciferasa significativamente más bajos para las células con p53 de tipo salvaje. [17]
La transfección de diferentes tipos de células con p53 de tipo salvaje se asoció con una fuerte represión del promotor de survivina. [17] No se demostró que la transfección con p53 mutante reprima fuertemente el promotor de survivina. [17] Se prepararon más construcciones de luciferasa con diversos grados de deleción del extremo 5 'de la región promotora de survivina. En un momento, hubo una deleción que hizo que los niveles de survivina fueran indiferentes a la presencia del plásmido de sobreexpresión de p53, lo que indica que hay una región específica próxima al sitio de inicio de la transcripción que se necesita para la supresión de p53 de la survivina. [17] Aunque se ha encontrado que dos sitios de unión de p53 están ubicados en el promotor del gen de survivina, el análisis mediante deleciones y mutaciones ha demostrado que estos sitios no son esenciales para la inactivación transcripcional. [17]
En cambio, se observa que la modificación de la cromatina dentro de la región promotora puede ser responsable de la represión transcripcional del gen de survivina. Esto se explica a continuación en la sección de regulación epigenética. [17]
Regulación del ciclo celular
Se muestra que la survivina está claramente regulada por el ciclo celular, ya que se encuentra que su expresión es dominante solo en la fase G2 / M. [13] Esta regulación existe a nivel transcripcional, ya que hay evidencia de la presencia de recuadros de la región de homología genética del ciclo celular / elemento dependiente del ciclo celular (CDE / CHR) localizados en la región promotora de survivina. [13] Otra evidencia para apoyar este mecanismo de regulación incluye la evidencia de que la surivina es poliubiquinada y degradada por proteasomas durante la interfase del ciclo celular. [13] Además, se ha demostrado que la survivina se localiza en los componentes del huso mitótico durante la metafase y la anafase de la mitosis. [13] La asociación física entre la tubulina polimerizada y la survivina también se ha demostrado in vitro . [13] También se muestra que la modificación postranscripcional de la survivina que implica la fosforilación de Thr34 conduce a una mayor estabilidad de la proteína en la fase G2 / M del ciclo celular. [13]
Se conoce de Mirza et al. que la represión de la survivina por p53 no es el resultado de ninguna regulación progresiva del ciclo celular. El mismo experimento de Mirza et al. Con respecto a la determinación de p53, se repitió la supresión de la survivina a nivel transcripcional, pero esta vez para las células detenidas en diferentes etapas del ciclo celular. Se demostró que, aunque p53 detiene el número de células en diferentes grados en diferentes fases, el nivel medido de ARNm de survivina y los niveles de proteína eran los mismos en todas las muestras transfectadas con p53 de tipo salvaje. Esto muestra que p53 actúa de manera independiente del ciclo celular para inhibir la expresión de survivina. [17]
Regulación epigenética y genética
Como se observa en la bibliografía, se encuentra que la survivina se sobreexpresa en muchos tipos de tumores. Los científicos no están seguros del mecanismo que causa esta sobreexpresión anormal de survivina; sin embargo, p53 está regulado a la baja en casi todos los cánceres, por lo que es tentador sugerir que la sobreexpresión de survivina se debe a la inactividad de p53. Wagner y col. investigó el posible mecanismo molecular involucrado con la sobreexpresión de survivina en la leucemia mieloide aguda (LMA). En sus experimentos, hicieron un análisis epigenético y genético de la región promotora del gen de survivina en pacientes con AML y compararon las observaciones con lo que se observó en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se ha demostrado que no expresan survivina. Suponiendo que el mecanismo molecular de la reexpresión de survivina en células cancerosas está a nivel transcripcional, los autores decidieron observar partes particulares de la región promotora de survivina para ver qué sucede en las células cancerosas que no sucede en las células normales que hace que se exprese un nivel tan alto de survivina. Con respecto a un mecanismo epigenético de regulación del gen de survivina, los autores midieron el estado de metilación del promotor de survivina, ya que se acepta que la metilación de genes juega un papel importante en la carcinogénesis al silenciar ciertos genes o viceversa. Los autores utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación con métodos de secuenciación de bisulfito para medir el estado de metilación del promotor en AML y PBMC y encontraron promotores de survivina no metilados en ambos grupos. [18] Este resultado muestra que el estado de metilación del ADN no es un regulador importante de la reexpresión de survivina durante la leucemogénesis. [18] Sin embargo, De Carvalho et al. realizaron un cribado de metilación del ADN e identificaron que la metilación del ADN de IRAK3 desempeña un papel clave en la regulación positiva de la survivina en diferentes tipos de cáncer, [19] lo que sugiere que los mecanismos epigenéticos desempeñan un papel indirecto en la sobreexpresión anormal de la survivina. Con respecto al análisis genético de la región promotora de survivina, el ADN aislado de AML y PBMC se trató con bisulfito, y la secuencia de la región promotora de survivina se amplificó con PCR y se secuenció para buscar cambios genéticos particulares en la secuencia de ADN entre los dos. grupos. Se identificaron tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y todos estaban presentes tanto en pacientes con AML como en donantes sanos. Este resultado sugiere que la aparición de estos SNP en la región promotora del gen de survivina también parece no tener importancia para la expresión de survivina. [18] Sin embargo, aún no se ha descartado que pueda haber otros posibles mecanismos epigenéticos que puedan ser responsables de un alto nivel de expresión de survivina observado en células cancerosas y no en células normales. Por ejemplo, también puede observarse el perfil de acetilación de la región promotora de survivina. Los diferentes tipos de cáncer y tejido pueden tener diferencias leves o significativas en la forma en que se regula la expresión de survivina en la célula y, por lo tanto, se puede observar que el estado de metilación o las diferencias genéticas en el promotor de survivina son diferentes en diferentes tejidos. Por lo tanto, se deben investigar más experimentos que evalúen el perfil epigenético y genético de diferentes tipos de tumores.
Como objetivo de las drogas
Expresión en cáncer como herramienta para la terapia dirigida al cáncer
Se sabe que la survivina se expresa altamente en la mayoría de los tipos de células tumorales y está ausente en las células normales, por lo que es un buen objetivo para la terapia del cáncer. [20] [21] [22] [23] [24] La explotación del promotor hiperactivo de survivin en la mayoría de los tipos de células cancerosas permite la administración de agentes terapéuticos solo en las células cancerosas y se eliminan de las células normales. [25]
Los ARN de interferencia pequeños (ARNip) son oligonucleótidos antisentido sintéticos para el ARNm del gen de interés que actúa para silenciar la expresión de un gen en particular mediante su unión complementaria. Los ARNip, como LY2181308 , unidos al ARNm respectivo dan como resultado la interrupción de la traducción de ese gen en particular y, por lo tanto, la ausencia de esa proteína en la célula. Por lo tanto, el uso de ARNip tiene un gran potencial para ser terapéutico en humanos, ya que puede apuntar y silenciar la expresión de potencialmente cualquier proteína que desee. Surge un problema cuando no se puede controlar la expresión de ARNip en una célula, lo que permite que su expresión constitutiva cause efectos secundarios tóxicos. Con respecto al tratamiento práctico del cáncer, se requiere administrar los ARNip específicamente en las células cancerosas o controlar la expresión del ARNip. Los métodos anteriores de terapia de ARNip emplean el uso de secuencias de ARNip clonadas en vectores bajo el control de promotores constitutivamente activos. [25] Esto causa un problema, ya que este modelo no es específico de las células cancerosas y también daña las células normales. [25] Sabiendo que la survivina se sobreexpresa específicamente en las células cancerosas y está ausente en las células normales, se puede implicar que el promotor de la survivina solo está activo en las células cancerosas. Por tanto, el aprovechamiento de esta diferencia entre las células cancerosas y las células normales permitirá una terapia apropiada dirigida solo a las células de un paciente que son dañinas. En un experimento para demostrar esta idea, Trang et al. han creado un vector específico de cáncer que expresa ARNip para la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor de survivina humana. Se cotransfectaron células de cáncer de mama MCF7 con este vector y también con un vector que expresa GFP. Su principal hallazgo fue que las células MCF7 transfectadas con el vector de ARNip para GFP bajo el promotor de survivina tenían una reducción significativa en la expresión de GFP y luego las células transfectadas con el vector de ARNip bajo un promotor no específico de cáncer. [25] Además, las células no cancerosas normales transfectadas de la misma manera mencionada anteriormente no mostraron una reducción significativa en la expresión de GFP. [25] Esto implica que, en células normales, el promotor de survivina no está activo y, por lo tanto, el ARNip no se expresará bajo un promotor de survivina inactivo. [25]
Oligonucleótidos antisentido dirigidos al ARNm de survivina
Como se sabe, la survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres, lo que puede estar contribuyendo a la resistencia de las células cancerosas a los estímulos apoptóticos del entorno. El uso de la terapia de survivina antisentido espera hacer que las células cancerosas sean susceptibles a la apoptosis al eliminar la expresión de survivina en las células cancerosas. [8]
Olie y col. desarrollaron diferentes oligonucleótidos antisentido de fosforotioato de 20 mer que se dirigen a diferentes regiones en el ARNm del gen de survivina. La función antisentido de los oligonucleótidos permite la unión al ARNm superviviente y, dependiendo de la región a la que se une, podría inhibir que el ARNm superviviente se traduzca en una proteína funcional. Se usó PCR en tiempo real para evaluar los niveles de ARNm presentes en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 que sobreexpresa la survivina. Se identificó el mejor oligonucleótido antisentido que regulaba a la baja de manera efectiva los niveles de ARNm de survivina y daba como resultado la apoptosis de las células. El papel de Survivin en el desarrollo del cáncer en el contexto de una vía de señalización es su capacidad para inhibir la activación de caspasa-3 y -7 aguas abajo de los estímulos que inducen la apoptosis. La sobreexpresión de survivina en tumores puede servir para aumentar la resistencia de los tumores a la apoptosis y, por tanto, contribuir a la inmortalidad celular incluso en presencia de estímulos de muerte. [25] En este experimento, se descubrió que el oligonucleótido 4003 que se dirige a los nucleótidos 232-251 del ARNm de survivina es el más eficaz para regular a la baja los niveles de ARNm de survivina en la línea tumoral A549. [25] Los oligonucleótidos 4003 se introdujeron en las células tumorales mediante transfección. A continuación, se llevaron a cabo más experimentos en 4003. Uno de los experimentos adicionales implicó determinar el efecto dependiente de la dosis de 4003 sobre la regulación a la baja de los niveles de ARNm de survivina. Se encontró que una concentración de 400 nM dio como resultado una regulación negativa máxima del 70% del ARNm de survivina inicial presente. [25] Otro experimento en 4003 implicó evaluar cualquier efecto biológico o citotóxico que la regulación negativa de 4003 del ARNm de survivina tiene en las células A549 utilizando el ensayo MTT. El número de células A549 transfectadas con 4003 disminuyó significativamente al aumentar la concentración de 4003 en comparación con las células transfectadas con una forma de emparejamiento erróneo del 4003 o con el control de lipofectina. [25] Se hicieron muchas observaciones físicas que confirmaron la inducción de apoptosis en 4003. Por ejemplo, los lisados de las células tratadas con 4003 mostraron niveles aumentados de actividad proteasa de tipo caspasa-3; Se observó que los núcleos estaban condensados y la cromatina estaba fragmentada.
Inmunoterapia contra el cáncer
Survivin ha sido un objetivo de atención en los últimos años para la inmunoterapia contra el cáncer, ya que es un antígeno que se expresa principalmente en las células cancerosas y está ausente en las células normales. Esto se debe a que se considera que la survivina es un factor crucial en la supervivencia del tumor. Ha habido mucha evidencia acumulada a lo largo de los años que muestra la survivina como un antígeno potente que activa las células T, y ya se han iniciado ensayos clínicos para demostrar su utilidad en la clínica. [26]
Activación del sistema inmunológico adaptativo
A. Respuesta celular de las células T
La primera evidencia de reconocimiento y destrucción de CTL específicos de survivina se mostró en un ensayo en el que las células T citotóxicas (CTL) indujeron la lisis de células B transfectadas para presentar péptidos de survivina en su superficie. [26] Las células T CD8 + ingenuas fueron cebadas con células dendríticas y, por lo tanto, pudieron reconocer los péptidos específicos de survivina presentados en la superficie de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad I (MHC I) de las células B.
B. Respuesta de anticuerpos humorales
Al tomar muestras de sangre de pacientes con cáncer, los científicos han encontrado anticuerpos específicos para la survivina. [26] Estos anticuerpos estaban ausentes en las muestras de sangre de pacientes normales sanos. [26] Por lo tanto, esto muestra que la survivina puede provocar una respuesta inmune humoral completa. Esto puede resultar útil, ya que se podría medir el nivel de anticuerpos específicos de survivina en la sangre del paciente como un monitor de la progresión del tumor. [26] Al adquirir la respuesta humoral a los antígenos tumorales como la survivina, las células T CD4 + se activan para inducir a las células B a producir anticuerpos dirigidos contra los antígenos particulares.
El aislamiento de los anticuerpos específicos para péptidos de survivina es útil, ya que se puede observar la estructura y secuencia del surco de unión al epítopo del anticuerpo y, por lo tanto, deducir posibles epítopos que pueden encajar en ese surco de anticuerpo particular. [26] Por lo tanto, se puede determinar la porción de péptido particular de la proteína survivina que se une de manera más eficiente y más común a los anticuerpos humorales generados contra la survivina. Esto conducirá a la producción de vacunas de survivina más específicas que contienen una porción específica de la proteína de survivina que se sabe que provoca una buena respuesta inmune, genera memoria inmune y permite la protección contra el desarrollo de tumores.
Sobreexpresión en tumores y tejidos metastásicos
Xiang y col. encontraron un nuevo enfoque en la inhibición del crecimiento tumoral y la metástasis al atacar simultáneamente tanto el tumor como su vasculatura mediante una respuesta de células T citotóxicas (CTL) contra la proteína survivina, que luego dará como resultado la activación de la apoptosis en las células tumorales. [27]
La idea y el principio general detrás de esta técnica se describen a continuación. Los ratones se inmunizaron con la vacuna oral y luego se sometieron a desafíos tumorales inyectándolos en el pecho con un cierto número de células tumorales y una matriz extracelular preformada con Matrigel para mantener unidas las células tumorales. Los ratones se sacrificaron y el tejido del endotelio se tiñó con un tinte fluorescente que ayudaría en la cuantificación de la neovascularización del tumor usando un ensayo de Matrigel. Se encontró que había una diferencia significativa entre los grupos de control y de prueba, por lo que los ratones que recibieron la vacuna tuvieron menos angiogénesis por la exposición al tumor que los ratones de control a los que no se les administró nada de la vacuna antes de la exposición al tumor. [27] También se realizaron ensayos in vitro y otras pruebas para validar la idea de la ocurrencia de una respuesta inmune real para respaldar lo que observaron en los ratones. [27] Por ejemplo, se aisló el bazo de los ratones expuestos y se midió la presencia de citocinas y grupos de células inmunitarias específicamente activados que indicarían que se produjo una respuesta inmunitaria específica tras la vacunación. Los CTL aislados específicos para la proteína survivina después de la vacunación de los ratones se usaron en ensayos de citotoxicidad en los que se demostró que las células tumorales de ratones que expresaban survivina murieron tras la incubación con los CTL específicos. [27]
Mediante el uso de una vacuna de ADN oral transportada en una forma no virulenta atenuada de Salmonella typhimurium, que codificaba conjuntamente la quimiocina secretora CCL21 y la proteína survivina en ratones C57BL / 6J, Xiang et al. han podido provocar una respuesta inmune llevada a cabo por células dendríticas (DC) y CTL para eliminar y suprimir las metástasis pulmonares del carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Es muy probable que la activación de la respuesta inmune tenga lugar en el órgano linfoide secundario llamado parche de Peyer en el intestino delgado, donde las CD absorben la proteína survivina por fagocitosis y la presentan en sus receptores de superficie a células T CD8 + ingenuas (CTL no inactivadas) para lograr una respuesta inmune específica dirigida exclusivamente a la survivina. [27] Los CTL activados específicos para un antígeno particular matan sus células diana al reconocer primero partes de la proteína survivina expresada en las proteínas MHC I (inmunohistocompatibilidad) que se presentan en la superficie de las células tumorales y la vasculatura y luego liberan gránulos que inducen a las células tumorales a sufrir apoptosis. La vacuna de ADN contenía la quimiocina secretora CCL21 como una forma de aumentar la probabilidad de provocar la respuesta inmune al mediar mejor la interacción física de las CD presentadoras de antígeno y las células T CD8 + ingenuas, lo que resulta en una mayor probabilidad de activación inmune. [27]
Sensibilización mediada por resveratrol
Fulda et al. que el compuesto natural resveratrol (un polifenol que se encuentra en las uvas y el vino tinto) se puede utilizar como sensibilizador para la apoptosis inducida por fármacos anticancerosos mediante la acción de provocar la detención del ciclo celular. [28] Esta detención del ciclo celular causa una disminución dramática en los niveles de survivina en las células, ya que se sabe por la literatura que la expresión de survivina está altamente relacionada con el estado de fase del ciclo celular. Por lo tanto, la disminución de la survivina, que es un factor que contribuye a la resistencia a la quimioterapia y a las terapias de inducción de apoptosis, haría que las células cancerosas fueran más propensas a tales tratamientos contra el cáncer. Fulda y col. han demostrado los beneficios del resveratrol a través de una serie de experimentos. Primero, los autores del artículo probaron los efectos citotóxicos intrínsecos del resveratrol. Descubrieron que inducía niveles moderados de apoptosis solo en células de neuroblastoma SHEP. [28] Después, probaron el resveratrol en combinación con varios agentes anticancerosos conocidos. Encontraron un aumento constante en el nivel de apoptosis inducida por los fármacos cuando también estaba presente el resveratrol. [28] Además, variaron el orden en el que se introdujeron los fármacos o el resveratrol en las células cancerosas para determinar si la secuencia del tratamiento tenía algún efecto importante. Se encontró que los niveles más altos de inducción de apoptosis se observaron cuando se agregó resveratrol antes del tratamiento con medicamentos contra el cáncer. [28] A continuación, los autores probaron cualquier sensibilidad diferencial a la apoptosis relacionada con la fase del ciclo celular en la que se encontraban las células. El análisis por citometría de flujo reveló una acumulación de células en la fase S tras el tratamiento con resveratrol. Las células también se detuvieron en diferentes fases del ciclo celular utilizando compuestos especiales y luego se trataron con los medicamentos contra el cáncer. Descubrieron que las células detenidas en la fase S eran significativamente más sensibles a los efectos citotóxicos de los fármacos. [28]
Para determinar la participación de la survivina en la sensibilización mediada por resveratrol, los autores decidieron probar si la regulación a la baja de la expresión de la proteína survivina específica conferiría un efecto similar en el fenotipo de las células tratadas con resveratrol. En términos de ver a qué nivel funcionaba el resveratrol, hicieron una transferencia Northern y encontraron que el tratamiento con resveratrol resultó en una disminución en los niveles de ARNm de survivina, [28] lo que implica la acción inhibidora del resveratrol a nivel transcripcional. Para ver más a fondo si la survivina desempeñaba un papel clave en la sensibilización de las células cancerosas a los fármacos citotóxicos, se utilizaron oligonucleótidos antisentido de survivina para eliminar cualquier ARNm de survivina y, por lo tanto, también se elimina su posibilidad de traducirse. Los ARNip para la survivina son complementos en secuencia de la secuencia de ARNm que codifica la survivina. Cuando estos ARNip para la survivina se introducen en las células, se unirán al ARNm complementario respectivo y, por lo tanto, evitarán su traducción, ya que ahora el ARNm no tiene una interacción física adecuada con la maquinaria de traducción. De esta manera, los ARNip de la survivina regulan a la baja de manera efectiva el nivel de expresión de la survivina en la célula. Las células tratadas con oligonucleótidos antisentido para la survivina mostraron una sensibilización similar a los fármacos citotóxicos como las células tratadas con resveratrol, que ofrece apoyo para el mecanismo de acción del resveratrol. [28]
Cancer de prostata
Se ha observado que el desarrollo de resistencia hormonal en el cáncer de próstata puede deberse a la regulación positiva de genes antiapoptóticos, uno de los cuales es la survivina. [29]
Zhang y col. plantean la hipótesis de que, si la survivina es un contribuyente significativo al desarrollo de la resistencia a la terapia hormonal en las células del cáncer de próstata, apuntar a la survivina y bloquearla mejoraría la susceptibilidad de las células del cáncer de próstata a la terapia antiandrógena. (La terapia anti-andrógenos usa fármacos para eliminar la presencia de andrógenos en la célula y el entorno celular, ya que se sabe que dichos andrógenos mejoran la inmortalidad tumoral en las células de cáncer de próstata). Zhang et al. Primero evaluó el nivel de expresión de survivina de LNCaP (una línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos que expresa receptores de andrógenos intactos) usando análisis Western cuantitativo y encontró una alta expresión de survivina en estas células. [29] Las células expuestas a la dihidrotestosterona (DHT), un andrógeno exógeno, mostraron niveles aumentados de expresión de survivina solamente y no otros miembros de la familia IAP. [29] Este resultado sugiere que los andrógenos pueden regular al alza la survivina, lo que contribuye a la resistencia a la apoptosis observada en las células tumorales. [29] Luego, con la adición de flutamida (un antiandrógeno) a las células, se observó que los niveles de survivina disminuían significativamente. [29] Las células LNCaP se transdujeron por separado con las diferentes construcciones del gen de survivina (mutante o de tipo salvaje) y se sometieron a tratamiento con flutamida y se evaluó el nivel de apoptosis. Se demostró que las células transducidas con mutantes de survivina tratadas con flutamida aumentan significativamente la apoptosis al doble que con el tratamiento con flutamida sola. [29] En el otro extremo, se encontró que la sobreexpresión de la survivina de tipo salvaje reduce significativamente los niveles de apoptosis del tratamiento con flutamida en comparación con el tratamiento con flutamida sola. [29] Por lo tanto, estos resultados apoyan la hipótesis de que la survivina juega un papel en la naturaleza antiapoptótica de la línea celular de cáncer LNCaP y que la inhibición de la survivina en las células de cáncer de próstata parece mejorar el efecto terapéutico de la flutamida.
Interacciones
Se ha demostrado que Survivin interactúa con:
- Aurora B quinasa , [30] [31]
- CDCA8 , [32] [33]
- Caspasa 3 , [14] [34]
- Caspasa 7 , [14] [34]
- Homólogo de Diablo [35] y
- INCENP . [30]
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