En la biología molecular de proteinasa K ( EC 3.4.21.64 , la proteasa K , endopeptidasa K , Tritirachium alcalina proteinasa , Tritirachium album serina proteinasa , Tritirachium album proteinasa K ) es un amplio espectro de la proteasa de serina . [2] [3] [4] La enzima se descubrió en 1974 en extractos del hongo Engyodontium album (anteriormente Tritirachium album ). [5] La proteinasa K es capaz de digerir el cabello (queratina ), de ahí el nombre "Proteinasa K". El sitio predominante de escisión es el enlace peptídico adyacente al grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos alfa amino bloqueados . Se usa comúnmente por su amplia especificidad. Esta enzima pertenece a la familia de las peptidasas S8 ( subtilisina ). El peso molecular de la proteinasa K es de 28.900 daltons (28,9 kDa).
Proteinasa K | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
CE no. | 3.4.21.64 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
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Proteinasa K | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | PROK | |||||
UniProt | P06873 | |||||
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Actividad enzimática
Activada por el calcio, la enzima digiere las proteínas preferentemente después de los aminoácidos hidrófobos (alifáticos, aromáticos y otros aminoácidos hidrófobos). Aunque los iones de calcio no afectan la actividad enzimática, contribuyen a su estabilidad. Las proteínas se digieren completamente si el tiempo de incubación es largo y la concentración de proteasa lo suficientemente alta. Tras la eliminación de los iones calcio, la estabilidad de la enzima se reduce, pero la actividad proteolítica permanece. [6] La proteinasa K tiene dos sitios de unión para Ca 2+ , que se encuentran cerca del centro activo, pero no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico. La actividad residual es suficiente para digerir las proteínas, que habitualmente contaminan las preparaciones de ácidos nucleicos. Por tanto, la digestión con proteinasa K para la purificación de ácidos nucleicos se realiza habitualmente en presencia de EDTA (inhibición de enzimas dependientes de iones metálicos como las nucleasas).
La proteinasa K también es estable en un amplio rango de pH (4–12), con un pH óptimo de 8,0. [5] Una elevación de la temperatura de reacción de 37 ° C a 50-60 ° C puede aumentar la actividad varias veces, como la adición de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.5-1% o cloruro de guanidinio (3 M), tiocianato de guanidinio (1 M) y urea (4 M) [en disputa (para: no se cita una fuente para la temperatura) ] . Las condiciones mencionadas anteriormente mejoran la actividad de proteinasa K haciendo que los sitios de escisión de sus sustratos sean más accesibles. Las temperaturas superiores a 65 ° C, el ácido tricloroacético (TCA) o los inhibidores de la serina proteasa AEBSF , PMSF o DFP inhiben la actividad. La proteinasa K no será inhibida por cloruro de guanidinio , tiocianato de guanidinio , urea , Sarkosyl , Triton X-100 , Tween 20 , SDS , citrato , ácido yodoacético , EDTA o por otros inhibidores de serina proteasa como Nα-Tosyl-Lys Clorometilcetona (TLCK) y Nα-Tosil-Phe Clorometilcetona (TPCK) [ cita requerida ] .
Actividad de la proteasa K en tampones de uso común [7]
Tampón (pH = 8,0, 50 ° C, 1,25 µg / ml de proteasa K, 15 min de incubación) | Actividad de la proteinasa K (%) |
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Tris · Cl 30 mM | 100 |
Tris · Cl 30 mM; EDTA 30 mM; Tween 20 al 5% ; Triton X-100 al 0,5% ; GuHCl 800 mM | 313 |
Tris · Cl 36 mM; EDTA 36 mM; Tween 20 al 5% ; 0,36% de Triton X-100 ; 735 mM de GuHCl | 301 |
Tris · Cl 10 mM; EDTA 25 mM; NaCl 100 mM; SDS al 0,5% | 128 |
Tris · Cl 10 mM; EDTA 100 mM; NaCl 20 mM; Sarkosyl al 1% | 74 |
Tris · Cl 10 mM; KCl 50 mM; MgCl _ { 2 } 1,5 mM ; Tween 20 al 0,45% ; 0,5% de Triton X-100 | 106 |
Tris · Cl 10 mM; EDTA 100 mM; SDS al 0,5% | 120 |
Tris · Cl 30 mM; EDTA 10 mM; SDS al 1% | 203 |
Aplicaciones
La proteinasa K se usa comúnmente en biología molecular para digerir proteínas y eliminar la contaminación de las preparaciones de ácido nucleico . La adición de proteinasa K a las preparaciones de ácido nucleico inactiva rápidamente las nucleasas que, de otro modo, podrían degradar el ADN o el ARN durante la purificación. Es muy adecuado para esta aplicación ya que la enzima es activa en presencia de químicos que desnaturalizan proteínas, como SDS y urea , agentes quelantes como EDTA , reactivos de sulfhidrilo , así como inhibidores de tripsina o quimotripsina . La proteinasa K se utiliza para la destrucción de proteínas en lisados celulares (tejido, células de cultivo celular) y para la liberación de ácidos nucleicos, ya que inactiva de forma muy eficaz las ADNasas y RNasas. Algunos ejemplos de aplicaciones: La proteinasa K es muy útil en el aislamiento de ADN o ARN altamente nativos y no dañados, ya que la mayoría de las ADNasas y ARNasas microbianas o de mamíferos son rápidamente inactivadas por la enzima, particularmente en presencia de SDS al 0,5-1%. Purificación de ADN genómico de bacterias (minipreparación): las bacterias de un cultivo líquido saturado se lisan y las proteínas se eliminan mediante una digestión con 100 μg / ml de Proteinasa K durante 1 ha 37 ° C;
La actividad de la enzima hacia las proteínas nativas es estimulada por desnaturalizantes como el SDS. Por el contrario, cuando se miden utilizando sustratos peptídicos , los desnaturalizantes inhiben la enzima. La razón de este resultado es que los agentes desnaturalizantes despliegan los sustratos proteicos y los hacen más accesibles a la proteasa. [8]
Inhibidores
La proteinasa K tiene dos enlaces disulfuro, [9] pero exhibe una mayor actividad proteolítica en presencia de agentes reductores (por ejemplo, DTT 5 mM ), [10] lo que sugiere que la presunta reducción de sus propios enlaces disulfuro no conduce a su inactivación irreversible. La proteinasa K es inhibida por inhibidores de serina proteasa tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo ( PMSF ), diisopropilfluorofosfato ( DFP ) o fluoruro de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo ( AEBSF ). La actividad de la proteinasa K no se ve afectada por los reactivos modificadores de sulfhidrilo: ácido paracloromercuribenzoico ( PCMB ), N-alfa-tosil-L-lisil-clorometilcetona ( TLCK ) o N-alfa-Tosil-l-fenilalanina clorometilcetona ( TPCK) ), [10] aunque presumiblemente si estos reactivos se incluyeron junto con reactivos reductores de disulfuro que exponían los tioles de proteinasa K que normalmente no están disponibles, puede inhibirse.
Referencias
- ^ Betzel C, Singh TP, Visanji M, Peters K, Fittkau S, Saenger W, Wilson KS (julio de 1993). "Estructura del complejo de proteinasa K con un inhibidor de hexapéptido análogo de sustrato a una resolución de 2.2-A" . J. Biol. Chem . 268 (21): 15854–8. doi : 10.1016 / S0021-9258 (18) 82332-8 . PMID 8340410 .
- ^ Morihara K, Tsuzuki H (1975). "Especificidad de la proteinasa K de Tritirachium album Limber para péptidos sintéticos" . Agric. Biol. Chem . 39 (7): 1489–1492. doi : 10.1271 / bbb1961.39.1489 .
- ^ Kraus E, Kiltz HH, Femfert UF (febrero de 1976). "La especificidad de la proteinasa K contra la cadena B de insulina oxidada". Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem . 357 (2): 233–7. PMID 943367 .
- ^ Jany KD, Lederer G, Mayer B (1986). "Secuencia de aminoácidos de proteinasa K del hongo Tritirachium album Limber". FEBS Lett . 199 (2): 139-144. doi : 10.1016 / 0014-5793 (86) 80467-7 . S2CID 85577597 .
- ^ a b Ebeling W, Hennrich N, Klockow M, Metz H, Orth HD, Lang H (agosto de 1974). "Proteinasa K de Tritirachium album Limber" . EUR. J. Biochem . 47 (1): 91–7. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1974.tb03671.x . PMID 4373242 .
- ^ Müller A, Hinrichs W, Wolf WM, Saenger W (septiembre de 1994). "Estructura cristalina de proteinasa K libre de calcio a una resolución de 1,5 A". J. Biol. Chem . 269 (37): 23108-11. doi : 10.2210 / pdb2pkc / pdb . PMID 8083213 .
- ^ Ag-Scientific. "Preguntas frecuentes sobre la proteinasa K" .
- ^ Hilz H, Wiegers U, Adamietz P (1975). "Estimulación de la acción de la proteinasa K por agentes desnaturalizantes: aplicación al aislamiento de ácidos nucleicos y la degradación de proteínas 'enmascaradas'" . Revista europea de bioquímica . 56 (1): 103–108. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1975.tb02211.x . PMID 1236799 .
- ^ "PROK - Precursor de la proteinasa K - Álbum de Parengyodontium" . Uniprot . 2019-12-11 . Consultado el 7 de febrero de 2020 .
- ^ a b "Protocolo de la proteinasa K de Novagen" (PDF) . Sigma Aldrich . 2019-12-11 . Consultado el 7 de febrero de 2020 .
enlaces externos
- Manual de la enzima de la proteinasa K Worthington