QPNC-PAGE , o electroforesis en gel de poliacrilamida continua nativa preparativa cuantitativa , es una técnica bioanalítica de alta resolución y alta precisión aplicada en bioquímica y química bioinorgánica para separar proteínas cuantitativamente por punto isoeléctrico . Esta variante estandarizada de electroforesis en gel nativo es utilizada por biólogos para aislar biomacromoléculas en solución, por ejemplo, metaloproteínas activas o nativas en muestras biológicas o cofactor de metal plegado de manera adecuada e incorrecta. -que contienen proteínas o isoformas de proteínas en mezclas de proteínas complejas . [1]
Introducción
Las proteínas realizan varias funciones en los organismos vivos , incluidas las reacciones catalíticas y el transporte de moléculas o iones dentro de las células , los órganos o todo el cuerpo . La comprensión de los procesos en los organismos humanos, que son impulsados principalmente por reacciones bioquímicas e interacciones proteína-proteína , depende en gran medida de nuestra capacidad para aislar proteínas activas en muestras biológicas para un examen más detallado de la estructura química y la función fisiológica . Esta información esencial puede implicar una indicación importante del estado de salud de un paciente . [2]
Como aproximadamente el 30-40% de todas las proteínas conocidas contienen uno o más cofactores de iones metálicos (por ejemplo, ceruloplasmina , ferritina , proteína precursora de amiloide , metaloproteinasa de matriz ), las metaloproteinas especialmente nativas deben aislarse, identificarse y cuantificarse después de una biopsia líquida . Muchos de estos cofactores (p. Ej., Hierro , cobre o zinc ) desempeñan un papel clave en los procesos catalíticos enzimáticos vitales o estabilizan las moléculas de proteínas globulares . [3] Por lo tanto, la electroforesis de alta precisión y otras técnicas de separación nativa son muy relevantes como paso inicial del análisis de especiación de proteínas y metales traza, seguido posteriormente por métodos de espectrometría de masas y resonancia magnética para cuantificar e identificar las proteínas solubles de interés. [4]
Método
Mecanismos de separación y amortiguación
En la electroforesis en gel, las proteínas normalmente se separan por carga , tamaño o forma . El objetivo del isoelectroenfoque (IEF), por ejemplo, es separar proteínas según su punto isoeléctrico (pI), es decir, según su carga a diferentes valores de pH . [5] Aquí, el mismo mecanismo se logra en una cámara de electroforesis disponible comercialmente (ver figura Equipo ) para separar biomoléculas cargadas , por ejemplo, superóxido dismutasa (SOD) [6] o alérgenos , [7] en condiciones de pH continuo y diferentes velocidades. de migración en función de diferentes puntos isoeléctricos. Las proteínas (metálicas) separadas eluyen secuencialmente, comenzando con el pI más bajo (pI> 2-4) y terminando con el pI más alto (pI <10,0) de las presentes moléculas de proteína.
Debido a las propiedades específicas del gel preparado y la solución tampón de electroforesis (que es básica y contiene Tris - HCl y NaN 3 ), la mayoría de las proteínas de un sistema biológico (p. Ej., Helicobacter pylori [8] ) se cargan negativamente en la solución, y migrará del cátodo al ánodo debido al campo eléctrico . En el ánodo, los iones de hidrógeno generados electroquímicamente reaccionan con las moléculas de Tris para formar iones Tris monovalentes . Los iones Tris cargados positivamente migran a través del gel al cátodo donde neutralizan los iones hidróxido para formar moléculas Tris y agua . Por tanto, el mecanismo de amortiguación basado en Tris provoca un pH constante en el sistema de amortiguación. [9] A 25 ° C, el tampón Tris tiene un rango de pH efectivo entre 7.5 y 9.0. En las condiciones dadas aquí (que se refieren a la concentración, el mecanismo tampón, el pH y la temperatura), el pH efectivo se desplaza en el rango de aproximadamente 10,0 a 10,5. Todos los sistemas de tampones nativos tienen una conductividad baja y un rango de pH de 3.8 a 10.2. Se utilizan sistemas tampón nativos continuos para separar proteínas según su pI. [10]
Aunque el valor de pH (10,00) del tampón de electroforesis no corresponde a un valor de pH fisiológico dentro de una célula o tipo de tejido , las bandas de proteína en forma de anillo separadas se eluyen continuamente en una solución tampón fisiológica (pH 8,00) y se aíslan en diferentes fracciones. (ver figura Electroferograma ). [11] Siempre que no se pueda demostrar una desnaturalización irreversible (mediante un procedimiento independiente), la mayoría de las moléculas de proteína son estables en solución acuosa, a valores de pH de 3 a 10 si la temperatura es inferior a 50 ° C. [12] Dado que el calor y la temperatura Joule generados durante la electroforesis pueden superar los 50 ° C, [13] y, por lo tanto, tener un impacto negativo en la estabilidad y el comportamiento de migración de las proteínas, el sistema de separación, incluida la cámara de electroforesis y un colector de fracciones, se enfría en nevera a 4 ° C. El sobrecalentamiento del gel es impedido por el enfriamiento interno de la columna de gel y generando una potencia constante (ver figura Equipo ).
Propiedades del gel y tiempo de polimerización.
Las mejores condiciones de polimerización para geles de acrilamida se obtienen a 25-30 ° C [14] y la polimerización parece terminar después de 20-30 min de reacción, aunque se detectan monómeros residuales (10-30%) después de este tiempo. [15] La copolimerización de monómero de acrilamida (AA) / N, N'-metilenbisacrilamida (Bis-AA) reticulante iniciada por reacciones de persulfato de amonio (APS) / tetrametiletilendiamina (TEMED), es más eficaz a pH alcalino. De ese modo, las cadenas de acrilamida se crean y se reticulan a la vez. Debido a las propiedades del tampón de electroforesis, la polimerización en gel se lleva a cabo a pH 10,00 asegurando un uso eficiente de TEMED y APS como catalizadores de la reacción de polimerización y, al mismo tiempo, suprimiendo una hidrólisis competitiva de la red de polímero de acrilamida producida . De lo contrario, las proteínas podrían modificarse por reacción con monómeros de acrilamida no polimerizados, formando productos de aducción de acrilamida covalentes que pueden dar como resultado múltiples bandas. [dieciséis]
Además, el tiempo de polimerización de un gel puede afectar directamente a los tiempos de elución máxima de metaloproteínas separadas en el electroferograma debido a la compresión y dilatación de los geles y sus poros con los tiempos de incubación más largos (ver figura Electroferograma , cf. Reproducibilidad y recuperación ). Para garantizar la máxima reproducibilidad en el tamaño de los poros del gel y para obtener un gel de poros grandes completamente polimerizado y no restrictivo para una ejecución PAGE, el gel de poliacrilamida se polimeriza durante un período de tiempo de 69 horas a temperatura ambiente (TA). El calor exotérmico generado por los procesos de polimerización se disipa constantemente mientras que la temperatura puede subir rápidamente a más de 75 ° C en los primeros minutos, después de lo cual desciende lentamente. [17] Después de 69 horas, el gel ha alcanzado la temperatura ambiente y, por lo tanto, está en su estado de energía más baja porque las reacciones químicas y la gelificación terminan. La gelificación significa que el solvente (agua) se inmoviliza dentro de la red del polímero por medio de enlaces de hidrógeno y también fuerzas de van der Waals . Como resultado, el gel preparado es homogéneo (en términos de distribución homogénea de enlaces cruzados en toda la muestra de gel [18] ), inherentemente estable y libre de monómeros o radicales . Los geles de poliacrilamida frescos son más hidrófilos , eléctricamente neutros y no se unen a proteínas. [19] Los efectos de tamizado debidos a la compresión del gel inducida por la gravedad pueden excluirse por las mismas razones. En un medio sin propiedades de tamizado molecular se puede esperar una alta resolución. [20]
Antes de que se inicie un ciclo electroforético, el gel preparado al 4% de T (contenido total de polímero (T)), 2,67% de C (concentración de reticulante (C)) se procesa previamente para equilibrarlo. Es esencialmente no tamizado y óptimo para la electroforesis de proteínas mayores o iguales a 200 ku (cf. electroforesis en gel de agarosa ). Las proteínas migran en él más o menos sobre la base de su libre movilidad. [21] Por estas razones, las interacciones del gel con las biomoléculas son insignificantemente bajas y, por lo tanto, las proteínas se separan de manera limpia y predecible en un tiempo de polimerización de 69 h (ver figura Electroferograma ). Las metaloproteínas separadas incluyendo biomoléculas que van desde aproximadamente <1 ku a más de 30 ku (por ejemplo, de metal chaperones , priones , proteínas de transporte de metal, los amiloides , metaloenzimas, metalo péptidos , metalotioneína , fitoquelatinas ) no se disocian en apoproteínas y cofactores metálicos. [22]
Reproducibilidad y recuperación
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/3/3c/Preparative_Electroph.TIF/lossless-page1-315px-Preparative_Electroph.TIF.png)
Las estructuras bioactivas ( conformación o forma nativa o 3D ) de las moléculas de proteína aisladas no sufren ningún cambio conformacional significativo . Por tanto, las proteínas que contienen cofactores metálicos activos pueden aislarse de forma reproducible en las mismas fracciones después de una serie de PAGE (ver figura Electroferograma ). Un pico de desplazamiento en el electroferograma respectivo puede indicar que el tiempo estandarizado de polimerización en gel (69 h, RT) no se implementa en un experimento PAGE . Una desviación más baja del tiempo de polimerización estandarizado (<69 h) significa una polimerización incompleta y, por lo tanto, una inestabilidad inherente debido al ablandamiento del gel durante la reticulación de los polímeros a medida que el material alcanza el equilibrio de hinchamiento, [23] mientras que se excede este límite de tiempo (> 69 h) es un indicador del envejecimiento del gel. [24] El fenómeno del envejecimiento del gel está estrechamente relacionado con la disminución de la viscosidad a largo plazo de las soluciones acuosas de poliacrilamida [25] y el aumento de la hinchazón de los hidrogeles. [26]
En condiciones estándar (69 h), se han recuperado metaloproteínas con diferentes rangos de masa molecular y puntos isoeléctricos en forma biológicamente activa con un rendimiento cuantitativo de más del 95%. [27] Mediante electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida con SDS, se pueden recuperar proteínas estándar ( citocromo c , aldolasa , ovoalbúmina y albúmina de suero bovino ) con masas moleculares de 14-66 ku con un rendimiento medio de aproximadamente 73,6%. [28] La isotacoforesis preparativa (ITP) se aplica para aislar proteínas que contienen paladio con masas moleculares de 362 ku (recuperación: 67%) y 158 ku (recuperación: 97%). [29]
Cuantificación e identificación
Las concentraciones fisiológicas ( rango de ppb ) de Fe, Cu, Zn, Ni , Mo , Pd, Co , Mn , Pt , Cr , Cd y otros cofactores metálicos pueden identificarse y cuantificarse absolutamente en una alícuota de una fracción por masa plasmática acoplada inductivamente espectrometría (ICP-MS) [30] o fluorescencia de rayos X de reflexión total (TXRF), [31] por ejemplo. En el caso de ICP-MS, la información estructural de las metalobiomoléculas asociadas [32] se pierde irreversiblemente debido a la ionización de la muestra con plasma . [33] Otro método de detección de alta sensibilidad establecido para la determinación de elementos (traza) es la espectrometría de absorción atómica en horno de grafito (GF-AAS) (ver figura Electroferograma ). [34] Debido a la alta pureza y la concentración optimizada de las metaloproteínas separadas, por ejemplo, los fármacos recombinantes terapéuticos elaborados con plantas , como el chaperón de cobre para la superóxido dismutasa (CCS) de plantas medicinales , en unas pocas fracciones específicas de PAGE, las estructuras relacionadas de estos los analitos se pueden dilucidar cuantitativamente utilizando espectroscopía de RMN en solución en condiciones no desnaturalizantes. [35]
Aplicaciones
Las proteínas metálicas plegadas incorrectamente, por ejemplo, CCS o Cu / Zn-superóxido dismutasa (SOD1) presentes en el cerebro , sangre u otras muestras clínicas, son indicativas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). [36] Las moléculas activas de CCS o SOD contribuyen al control homeostático intracelular de iones metálicos esenciales (p. Ej., Cu 1 + / 2 + , Zn 2+ , Fe 2 + / 3 + , Mn 2+ , Ni 3+ ) en organismos, y por tanto, estas biomoléculas pueden equilibrar los procesos prooxidativos y antioxidantes en el citoplasma . De lo contrario, los iones de metales de transición libres (débilmente unidos) participan en reacciones similares a las de Fenton en las que se forma un radical hidroxilo deletéreo , que sin restricciones sería destructivo para las proteínas. [37] La pérdida de CCS (activa) aumenta la producción de β-amiloide en las neuronas que, a su vez, es una característica patológica importante de la EA. [38] Por lo tanto, se propone que la chaperona de cobre para la superóxido dismutasa es uno de los biomarcadores más prometedores de toxicidad por Cu en estas enfermedades. [39] La CCS debe analizarse principalmente en sangre porque un metanálisis de los datos séricos mostró que los pacientes con EA tienen niveles más altos de Cu sérico que los controles sanos. [40]
Ver también
- Electroforesis
- Electroforesis en gel
- Electroforesis de proteínas
- Purificación de proteínas
- Metalome
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enlaces externos
- Los capítulos sobre electroforesis en gel 1-D / 2-D y enfoque isoeléctrico son proporcionados por AES Electrophoresis Society Learning Center: Foci
- Protocolos de purificación de proteínas de la Universidad Hebrea de Jerusalén