La genética inversa es un método de genética molecular que se utiliza para ayudar a comprender la función o funciones de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos causados por la ingeniería genética de secuencias de ácidos nucleicos específicas dentro del gen. El proceso avanza en la dirección opuesta para avanzar las pantallas genéticas de la genética clásica . Mientras que la genética directa busca encontrar la base genética de un fenotipo o rasgo, la genética inversa busca encontrar qué fenotipos están controlados por secuencias genéticas particulares.
La secuenciación automatizada de ADN genera grandes volúmenes de datos de secuencias genómicas con relativa rapidez. Muchas secuencias genéticas se descubren antes de otra información biológica, que se obtiene con menos facilidad. La genética inversa intenta conectar una secuencia genética determinada con efectos específicos en el organismo. [1]
Técnicas utilizadas
Para conocer la influencia que tiene una secuencia en el fenotipo, o para descubrir su función biológica, los investigadores pueden diseñar un cambio o alterar el ADN . Una vez realizado este cambio, el investigador puede buscar el efecto de tales alteraciones en todo el organismo . Hay varios métodos diferentes de genética inversa:
Deleciones dirigidas y mutaciones puntuales
La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica sofisticada que puede cambiar las regiones reguladoras en el promotor de un gen o realizar cambios sutiles de codones en el marco de lectura abierto para identificar residuos importantes de aminoácidos para la función de la proteína . [ cita requerida ]
Alternativamente, la técnica se puede utilizar para crear alelos nulos para que el gen no sea funcional. Por ejemplo, la eliminación de un gen mediante la selección de genes ( knockout de genes ) se puede realizar en algunos organismos, como levaduras , ratones y musgo . Único entre las plantas, en Physcomitrella patens , la eliminación genética mediante recombinación homóloga para crear musgo knockout (ver figura) es casi tan eficiente como en la levadura. [3] En el caso del modelo de levadura, se han creado deleciones dirigidas en todos los genes no esenciales del genoma de la levadura. [4] En el caso del sistema de modelo vegetal , se han creado enormes bibliotecas mutantes basadas en construcciones de alteración genética. [5] En el gen knock-in , el exón endógeno se reemplaza por una secuencia de interés alterada. [6]
En algunos casos, se pueden usar alelos condicionales para que el gen tenga una función normal hasta que se active el alelo condicional. Esto podría implicar "golpear" sitios de recombinasa (como sitios lox o frt) que causarán una deleción en el gen de interés cuando se induzca una recombinasa específica (como CRE, FLP). Las recombinasas Cre o Flp pueden inducirse con tratamientos químicos, tratamientos de choque térmico o restringirse a un subconjunto específico de tejidos. [ cita requerida ]
Otra técnica que se puede utilizar es LABRADO . Este es un método que combina una técnica estándar y eficiente de mutagénesis con un mutágeno químico como el metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica de detección de ADN sensible que identifica mutaciones puntuales en un gen objetivo. [ cita requerida ]
Silenciamiento de genes
El descubrimiento del silenciamiento génico mediante el uso de ARN bicatenario, también conocido como interferencia de ARN (ARNi), y el desarrollo de la eliminación de genes mediante oligos Morpholino , han hecho que la alteración de la expresión génica sea una técnica accesible para muchos más investigadores. Este método a menudo se conoce como eliminación de genes, ya que los efectos de estos reactivos son generalmente temporales, en contraste con las eliminaciones de genes que son permanentes. [ cita requerida ]
El ARNi crea un efecto de desactivación específico sin realmente mutar el ADN de interés. En C. elegans , se ha utilizado ARNi para interferir sistemáticamente con la expresión de la mayoría de los genes del genoma. El ARNi actúa dirigiendo los sistemas celulares para degradar el ARN mensajero objetivo (ARNm). [ cita requerida ]
La interferencia de ARNi, específicamente el silenciamiento de genes, se ha convertido en una herramienta útil para silenciar la expresión de genes e identificar y analizar su fenotipo de pérdida de función. Cuando se producen mutaciones en los alelos, la función que representa y codifica también se muta y se pierde; esto generalmente se denomina mutación con pérdida de función. [7] La capacidad de analizar el fenotipo de pérdida de función permite el análisis de la función de los genes cuando no hay acceso a los alelos mutantes. [8]
Mientras la interferencia de ARN se basa en los componentes celulares de la eficacia (por ejemplo, las proteínas Dicer, el complejo RISC) una alternativa simple para knockdown gen es morfolino oligos antisentido. Los morfolinos se unen y bloquean el acceso al ARNm diana sin requerir la actividad de las proteínas celulares y sin acelerar necesariamente la degradación del ARNm. Los morfolinos son eficaces en sistemas que varían en complejidad, desde la traducción sin células en un tubo de ensayo hasta estudios in vivo en modelos animales grandes. [ cita requerida ]
Interferencia usando transgenes
Un enfoque de genética molecular es la creación de organismos transgénicos que sobreexpresan un gen de interés normal. El fenotipo resultante puede reflejar la función normal del gen.
Alternativamente, es posible sobreexpresar formas mutantes de un gen que interfieren con la función del gen normal ( tipo salvaje ). Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen mutante puede resultar en niveles altos de una proteína no funcional que da como resultado una interacción negativa dominante con la proteína de tipo salvaje. En este caso, la versión mutante competirá por las proteínas asociadas de tipo salvaje, lo que dará como resultado un fenotipo mutante.
Otras formas mutantes pueden dar como resultado una proteína regulada anormalmente y constitutivamente activa ("encendida" todo el tiempo). Esto podría deberse a la eliminación de un dominio regulador o la mutación de un residuo amino específico que se modifica de forma reversible (por fosforilación , metilación o ubiquitinación ). Cualquiera de los cambios es fundamental para modular la función de las proteínas y, a menudo, resulta en fenotipos informativos.
Síntesis de vacunas
La genética inversa juega un papel importante en la síntesis de vacunas . Las vacunas pueden crearse mediante la ingeniería de genotipos novedosos de cepas virales infecciosas que disminuyen su potencia patógena lo suficiente como para facilitar la inmunidad en un huésped. El enfoque de genética inversa para la síntesis de vacunas utiliza secuencias genéticas virales conocidas para crear un fenotipo deseado: un virus con una potencia patológica debilitada y una similitud con la cepa de virus circulante actual. La genética inversa proporciona un enfoque conveniente al método tradicional de crear vacunas inactivadas , virus que han sido eliminados mediante calor u otros métodos químicos.
Las vacunas creadas mediante métodos de genética inversa se conocen como vacunas atenuadas , nombradas porque contienen virus vivos debilitados (atenuados). Las vacunas atenuadas se crean combinando genes de una cepa de virus nueva o actual con virus previamente atenuados de la misma especie. [9] Los virus atenuados se crean mediante la propagación de un virus vivo en condiciones nuevas, como un huevo de gallina. Esto produce una cepa viral que todavía está viva, pero no es patógena para los humanos, [10] ya que estos virus se vuelven defectuosos porque no pueden replicar su genoma lo suficiente para propagarse e infectar suficientemente a un huésped. Sin embargo, los genes virales todavía se expresan en la célula del huésped a través de un único ciclo de replicación, lo que permite el desarrollo de una inmunidad. [11]
Vacuna contra la influenza
Una forma común de crear una vacuna utilizando técnicas de genética inversa es utilizar plásmidos para sintetizar virus atenuados. Esta técnica se utiliza con mayor frecuencia en la producción anual de vacunas contra la influenza , donde un sistema de ocho plásmidos puede producir rápidamente una vacuna eficaz. El genoma completo del virus de la influenza A consta de ocho ARN. segmentos, por lo que la combinación de seis plásmidos de ADNc vírico atenuado con dos plásmidos de tipo salvaje permite construir una cepa de vacuna atenuada. Para el desarrollo de vacunas antigripales, los segmentos de ARN cuarto y sexto, que codifican las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa respectivamente, se toman del virus circulante, mientras que los otros seis segmentos se derivan de una cepa maestra previamente atenuada. Las proteínas HA y NA exhiben una gran variedad de antígenos y, por lo tanto, se toman de la cepa actual para la que se está produciendo la vacuna para crear una vacuna que coincida bien. [9]
Las secuencias de ADNc de ARN viral se sintetizan a partir de cepas maestras atenuadas utilizando RT-PCR . [9] Este ADNc puede insertarse entre una secuencia promotora y terminadora de la ARN polimerasa I (Pol I). La secuencia de ADNc y pol I está rodeada a su vez por un promotor de ARN polimerasa II (Pol II) y un sitio de poliadenilación . [12] Esta secuencia completa se inserta luego en un plásmido. Se cotransfectan seis plásmidos derivados del ADNc de la cepa maestra atenuada en una célula diana, a menudo un huevo de gallina, junto con dos plásmidos de la cepa de influenza de tipo salvaje que circula actualmente. Dentro de la célula diana, las dos enzimas Pol I y Pol II "apiladas" transcriben el ADNc viral para sintetizar tanto ARN viral de sentido negativo como ARNm de sentido positivo, creando efectivamente un virus atenuado. [9] El resultado es una cepa de vacuna defectuosa que es similar a la cepa de virus actual, lo que permite que un huésped desarrolle inmunidad. Esta cepa de vacuna sintetizada se puede utilizar como un virus semilla para crear más vacunas.
Ventajas y desventajas
Las vacunas diseñadas a partir de genética inversa tienen varias ventajas sobre los diseños de vacunas tradicionales. Lo más notable es la velocidad de producción. Debido a la alta variación antigénica en las glicoproteínas HA y NA , un enfoque de genética inversa permite que el genotipo necesario (es decir, uno que contenga proteínas HA y NA tomadas de las cepas de virus que circulan actualmente) se formule rápidamente. [9] Además, dado que el producto final de la producción de una vacuna atenuada por genética inversa es un virus vivo, se exhibe una mayor inmunogenicidad que en las vacunas inactivadas tradicionales, [13] que deben eliminarse mediante procedimientos químicos antes de ser transferidas como vacuna. Sin embargo, debido a la naturaleza viva de los virus atenuados, pueden surgir complicaciones en pacientes inmunodeficientes . [14] También existe la posibilidad de que una mutación en el virus pueda hacer que la vacuna vuelva a convertirse en un virus vivo no atenuado. [15]
Ver también
- Genética avanzada
Referencias
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enlaces externos
- Desde el Sitio del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID):
- Reordenamiento versus genética inversa
- Genética inversa: construyendo vacunas contra la influenza pieza por pieza
- Desde el Sitio del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI):
- Neumann G, Hatta M, Kawaoka Y (2003). "Genética inversa para el control de la influenza aviar". Enfermedades de las aves . 47 (Supl. 3): 882–7. doi : 10.1637 / 0005-2086-47.s3.882 . PMID 14575081 .
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