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Esquemas de amplificación de RT-LAMP, ejemplificados para la detección de SARS-CoV-2 .

La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa ( RT-LAMP ) es un método de amplificación de ácido nucleico de un paso para multiplicar secuencias específicas de ARN. Se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas causadas por virus ARN. [1]

Combina la detección de ADN LAMP [2] con la transcripción inversa , lo que genera ADNc a partir del ARN antes de ejecutar la reacción. [3] RT-LAMP no requiere ciclos térmicos (a diferencia de la PCR ) y se realiza a una temperatura constante entre 60 y 65 ° C.

RT-LAMP se utiliza en la detección de virus ARN (GrupoS II, IV y V en el sistema de clasificación de virus de Baltimore ), como el virus SARS-CoV-2 [4] y el virus Ébola . [5]

Aplicaciones [ editar ]

RT-LAMP se utiliza para probar la presencia de muestras de ARN específicas de virus para la secuencia específica del virus, lo que es posible al comparar las secuencias con una gran base de datos externa de referencias.

Detección del virus SARS-CoV2 [ editar ]

La técnica RT-LAMP está siendo respaldada como una alternativa más barata y fácil a la RT-PCR para el diagnóstico temprano de personas que son infecciosas por COVID-19 . [6] Existen diseños de prueba de acceso abierto (incluidas las proteínas recombinantes ) que hacen que sea legalmente posible para cualquier persona producir una prueba. A diferencia de las clásicas pruebas rápidas por flujo lateral , RT-LAMP permite el diagnóstico precoz de la enfermedad mediante la prueba del ARN viral . [7]

Las pruebas se pueden realizar sin aislamiento previo de ARN, detectando los virus directamente a partir de hisopos [8] o de saliva . [9]

Detección de virus no humanos [ editar ]

Un ejemplo de caso de uso de RT-LAMP fue un experimento para detectar un nuevo virus BYD similar al pato Tembusu, llamado así por la región, Baiyangdian , donde se aisló por primera vez [10] [11] [1] Otra aplicación reciente de este método, fue en un experimento de 2013 para detectar un virus Akabane usando RT-LAMP. El experimento, realizado en China, aisló el virus de fetos de terneros abortados. [12]

Metodología [ editar ]

Transcripción inversa [ editar ]

Una secuencia específica del cDNA es detectada por 4 cebadores LAMP . Dos de ellos son cebadores internos (FIP y BIP), que sirven como base para que la enzima Bst copie la plantilla en un nuevo ADN. Los cebadores externos (F3 y B3) se hibridan con la hebra molde y ayudan a que prosiga la reacción.

Como en el caso de la RT-PCR , el procedimiento de RT-LAMP comienza haciendo ADN a partir de la muestra de ARN. Esta conversión se realiza mediante una transcriptasa inversa , una enzima derivada de retrovirus capaz de realizar dicha conversión. [13] Este ADN derivado del ARN se denomina ADNc o ADN complementario. El cebador FIP es utilizado por la transcriptasa inversa para construir una sola hebra de copia de ADN. El cebador F3 también se une a este lado de la hebra de la plantilla y desplaza la copia realizada previamente.

Amplificación [ editar ]

Esta copia monocatenaria desplazada es una mezcla de ARN diana y cebadores. Los cebadores están diseñados para tener una secuencia que se une a la secuencia en sí, formando un bucle.

El cebador BIP se une al otro extremo de esta hebra simple y es utilizado por la polimerasa de ADN Bst para construir una hebra complementaria, haciendo ADN de doble hebra. El cebador F3 se une a este extremo y desplaza, una vez más, esta molécula de ADN monocatenario recién generada .

Esta nueva hebra única que se ha lanzado actuará como punto de partida para la amplificación del ciclo LAMP. Este ADN monocatenario tiene una estructura similar a una mancuerna , ya que los extremos se pliegan y se unen a sí mismos, formando dos bucles.

La ADN polimerasa y los cebadores FIP o BIP continúan amplificando esta hebra y el producto de reacción LAMP se extiende. Este ciclo se puede iniciar desde el lado hacia adelante o hacia atrás de la hebra usando el cebador apropiado. Una vez que este ciclo ha comenzado, la hebra se somete a una síntesis de ADN autocebante durante la etapa de alargamiento del proceso de amplificación. Esta amplificación se produce en menos de una hora, en condiciones isotérmicas entre 60 y 65 ° C.

Leer [ editar ]

La lectura de las pruebas RT-LAMP suele ser colorimétrica. Dos de las formas comunes se basan en medir el pH o los iones de magnesio . La reacción de amplificación hace que el pH baje y los niveles de Mg2 + bajen. Esto se puede percibir mediante indicadores, como el rojo de fenol , para el pH, y el azul de hidroxinaftol (HNB), para el magnesio. [13] Otra opción es utilizar SYBR Green I , un agente colorante que intercala el ADN. [14]

Detección colorimétrica de reacciones RT-LAMP en tubos Eppendorf.

Ventajas y desventajas [ editar ]

Ejemplo de instalación de RT-LAMP en un baño de agua, que requiere equipo económico en el BioCenter de Viena .

Este método es especialmente ventajoso porque todo se puede realizar rápidamente en un solo paso. La muestra se mezcla con los cebadores, la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa y la reacción tiene lugar a temperatura constante. La temperatura requerida se puede alcanzar usando un simple baño de agua caliente.

La PCR requiere termociclado ; RT-LAMP no lo hace, lo que lo hace más eficiente en tiempo y muy rentable. [3] Este método económico y simplificado se puede utilizar más fácilmente en países en desarrollo que no tienen acceso a laboratorios de alta tecnología.

Una desventaja de este método es la generación de cebadores específicos de secuencia. Para cada ensayo LAMP, los cebadores deben diseñarse específicamente para que sean compatibles con el ADN diana. Esto puede resultar difícil, lo que desalienta a los investigadores a utilizar el método LAMP en su trabajo. [1] Sin embargo, existe un software gratuito llamado Primer Explorer, desarrollado por Fujitsu en Japón, que puede ayudar en la selección de estos primers.

Referencias [ editar ]

  1. ↑ a b c Mori Y, Notomi T (2009). "Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP): un método de diagnóstico rápido, preciso y rentable para las enfermedades infecciosas" . J. Infect. Chemother . 15 (2): 62–9. doi : 10.1007 / s10156-009-0669-9 . PMC  7087713 . PMID  19396514 .
  2. ^ Notomi, Tsugunori; Okayama, Hiroto; Masubuchi, Harumi; Yonekawa, Toshihiro; Watanabe, Keiko; Amino, Nobuyuki; Hase, Tetsu (15 de junio de 2000). "Amplificación isotérmica mediada por bucle de ADN" . Investigación de ácidos nucleicos . 28 (12): e63. doi : 10.1093 / nar / 28.12.e63 . ISSN 0305-1048 . PMC 102748 . PMID 10871386 .   
  3. ↑ a b Fu S, Qu G, Guo S, Ma L, Zhang N, Zhang S, Gao S, Shen Z (2011). "Aplicaciones de la amplificación de ADN isotérmica mediada por bucle". Apl. Biochem. Biotechnol . 163 (7): 845–50. doi : 10.1007 / s12010-010-9088-8 . PMID 20844984 . S2CID 45682156 .  
  4. ↑ Habibzadeh, Parham; Mofatteh, Mohammad; Silawi, Mohammad; Ghavami, Saeid; Faghihi, Mohammad Ali (17 de febrero de 2021). "Ensayos de diagnóstico molecular para COVID-19: una descripción general" . Revisiones críticas en ciencias de laboratorio clínico : 1–20. doi : 10.1080 / 10408363.2021.1884640 . ISSN 1549-781X . PMC 7898297 . PMID 33595397 .   
  5. ^ Kurosaki, Yohei; Magassouba, N'Faly; Oloniniyi, Olamide K .; Cherif, Mahamoud S .; Sakabe, Saori; Takada, Ayato; Hirayama, Kenji; Yasuda, Jiro (22 de febrero de 2016). "Desarrollo y evaluación del ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) junto con un dispositivo portátil para el diagnóstico rápido de la enfermedad por el virus del Ébola en Guinea" . PLOS Enfermedades tropicales desatendidas . 10 (2): e0004472. doi : 10.1371 / journal.pntd.0004472 . ISSN 1935-2735 . PMC 4764121 . PMID 26900929 .   
  6. ^ "La prueba basada en LAMP podría permitir la prueba COVID-19 en el punto de atención" . Diagnósticos de Redes Tecnológicas . Consultado el 31 de julio de 2020 .
  7. ^ Alekseenko, Alisa; Barrett, Donal; Pareja-Sánchez, Yerma; Howard, Rebecca J .; Strandback, Emilia; Ampah-Korsah, Henry; Rovšnik, Urška; Zúñiga-Veliz, Silvia; Klenov, Alexander; Malloo, Jayshna; Ye, Shenglong (19 de enero de 2021). "Detección directa de SARS-CoV-2 utilizando reactivos RT-LAMP no comerciales en muestras inactivadas por calor" . Informes científicos . 11 (1): 1820. doi : 10.1038 / s41598-020-80352-8 . ISSN 2045-2322 . 
  8. ^ Lalli, Matthew A .; Langmade, S Joshua; Chen, Xuhua; Fronick, Catrina C .; Sawyer, Christopher S .; Burcea, Lauren C .; Wilkinson, Michael N .; Fulton, Robert S .; Heinz, Michael; Buchser, William J .; Jefe, Richard D .; Mitra, Robi D .; Milbrandt, Jeffrey (2020). "Detección rápida y sin extracción de SARS-CoV-2 de la saliva con LAMP colorimétrico" . MedRxiv . doi : 10.1101 / 2020.05.07.20093542 . PMC 7273276 . PMID 32511508 .  
  9. ^ Nagura-Ikeda, Mayu; Imai, Kazuo; Tabata, Sakiko; Miyoshi, Kazuyasu; Murahara, Nami; Mizuno, Tsukasa; Horiuchi, Midori; Kato, Kento; Imoto, Yoshitaka; Iwata, Maki; Mimura, Satoshi (24 de agosto de 2020). "Evaluación clínica de la saliva recolectada por uno mismo por PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR), RT-qPCR directa, amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa y una prueba rápida de antígeno para diagnosticar COVID-19" . Revista de microbiología clínica . 58 (9). doi : 10.1128 / JCM.01438-20 . ISSN 0095-1137 . PMID 32636214 .  
  10. ^ Vaidya NK, Wang FB, Zou X, Wahl LM (2012). "Dinámica de transmisión del virus BYD recientemente identificado que causa el síndrome de caída del huevo de pato" . PLOS ONE . 7 (4): e35161. Código Bibliográfico : 2012PLoSO ... 735161V . doi : 10.1371 / journal.pone.0035161 . PMC 3329443 . PMID 22529985 .  
  11. ^ Jiang T, Liu J, Deng YQ, Su JL, Xu LJ, Liu ZH, Li XF, Yu XD, Zhu SY, Gao GF, Qin ED, Qin CF (diciembre de 2012). "Desarrollo de ensayos RT-LAMP y RT-PCR en tiempo real para la detección rápida del nuevo virus BYD tipo Tembusu de pato". Arco. Virol . 157 (12): 2273–80. doi : 10.1007 / s00705-012-1431-7 . PMID 22865206 . S2CID 15573433 .  
  12. ^ Qiao J, Wang J, Meng Q, Wang G, Liu Y, He Z, Yang H, Zhang Z, Cai X, Chen C (2013). "Detección rápida del virus Akabane mediante un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa novedoso (RT-LAMP)" . Virol. J . 10 : 288. doi : 10.1186 / 1743-422X-10-288 . PMC 3848447 . PMID 24034624 .  
  13. ↑ a b Kellner, Max J .; Ross, James J .; Schnabl, Jakob; Dekens, Marcus PS; Heinen, Robert; Grishkovskaya, Irina; Bauer, Benedikt; Stadlmann, Johannes; Menéndez-Arias, Luis; Fritsche-Polanz, Robert; Traugott, Marianna (23 de julio de 2020). "Un ensayo de detección de SARS-CoV-2 rápido, altamente sensible y de acceso abierto para pruebas de laboratorio y en el hogar" . bioRxiv : 2020.06.23.166397. doi : 10.1101 / 2020.06.23.166397 . hdl : 10261/216969 . S2CID 220835822 . 
  14. ^ Bokelmann, Lukas; Níquel, Olaf; Maricic, Tomislav; Paabo, Svante; Meyer, Matthias; Borte, Stephan; Riesenberg, Stephan (6 de agosto de 2020). "Rápido, y la prueba confiable barato de punto de cuidado mayor para el SARS-CoV-2 mediante la combinación de la captura por hibridación con una mejor lámpara colorimétrica (Cap-iLamp)" . dx.doi.org . Consultado el 13 de octubre de 2020 .

Enlaces externos [ editar ]

  • Explorador de imprimaciones LAMP
  • Página de Scholia para RT-LAMP
  • Protocolos de acceso abierto para RT-LAMP para detectar SARS-CoV-2