SDS-PAGE
SDS-PAGE ( electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio ) es un sistema electroforético discontinuo desarrollado por Ulrich K. Laemmli que se utiliza comúnmente como método para separar proteínas con masas moleculares entre 5 y 250 kDa . [1] [2] El uso combinado de dodecilsulfato de sodio (SDS, también conocido como laurilsulfato de sodio) y gel de poliacrilamida permite eliminar la influencia de la estructura y la carga, y las proteínas se separan únicamente sobre la base de diferencias en su peso molecular. .
SDS-PAGE es un método de electroforesis que permite la separación de proteínas por masa. El medio (también denominado "matriz") es un gel discontinuo a base de poliacrilamida. El gel de poliacrilamida se intercala típicamente entre dos placas de vidrio en una placa de gel . Aunque los geles de tubo (en cilindros de vidrio) se usaron históricamente, rápidamente se volvieron obsoletos con la invención de los geles en placa más convenientes. [3] Además, se utiliza SDS ( dodecil sulfato de sodio ). Aproximadamente 1,4 gramos de SDS se unen a un gramo de proteína, [4] [5] [6] correspondientes a una molécula de SDS por dos aminoácidos . El SDS actúa como tensioactivo, enmascarando la carga intrínseca de las proteínas y confiriéndoles proporciones de carga a masa muy similares. Las cargas intrínsecas de las proteínas son insignificantes en comparación con la carga de SDS, y las cargas positivas también se reducen en gran medida en el rango de pH básico de un gel de separación. Tras la aplicación de un campo eléctrico constante, la proteína migra hacia el ánodo, cada uno con una velocidad diferente, dependiendo de su masa. Este sencillo procedimiento permite una separación precisa de proteínas por masa.
El SDS tiende a formar micelas esféricas en soluciones acuosas por encima de una cierta concentración llamada concentración micelar crítica (CMC). Por encima de la concentración micelar crítica de 7 a 10 milimolar en soluciones, el SDS se produce simultáneamente como moléculas individuales ( monómero ) y como micelas, por debajo de la CMC SDS aparece solo como monómeros en soluciones acuosas. En la concentración micelar crítica, una micela consta de aproximadamente 62 moléculas de SDS. [7] Sin embargo, solo los monómeros de SDS se unen a proteínas a través de interacciones hidrofóbicas, mientras que las micelas de SDS son aniónicas en el exterior y no adsorben ninguna proteína. [4] El SDS es de naturaleza anfipática, lo que le permite desplegar secciones polares y no polares de la estructura de la proteína.[8] En concentraciones de SDS por encima de 0,1 milimolar, comienza el despliegue de las proteínas, [4] y por encima de 1 mM, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan. [4] Debido al fuerte efecto desnaturalizante de SDS y la posterior disociación de complejos de proteínas, las estructuras cuaternarias generalmente no se pueden determinar con SDS. Las excepciones son las proteínas que se estabilizan mediante reticulación covalente.por ejemplo, enlaces -SS- y los complejos proteicos resistentes a SDS, que son estables incluso en presencia de SDS (este último, sin embargo, solo a temperatura ambiente). Para desnaturalizar los complejos resistentes a SDS se requiere una alta energía de activación, que se logra mediante calentamiento. La resistencia al SDS se basa en una metaestabilidad del pliegue proteico. Aunque la proteína nativa, completamente plegada, resistente a SDS no tiene suficiente estabilidad en presencia de SDS, el equilibrio químico de desnaturalización a temperatura ambiente ocurre lentamente. Los complejos de proteínas estables se caracterizan no solo por la resistencia al SDS sino también por la estabilidad frente a las proteasas y una vida media biológica aumentada . [9]
Alternativamente, la electroforesis en gel de poliacrilamida también se puede realizar con los tensioactivos catiónicos CTAB en un CTAB-PAGE, [10] [11] [12] o 16-BAC en un BAC-PAGE. [13]
El método SDS-PAGE se compone de preparación de gel, preparación de muestras, electroforesis, tinción de proteínas o transferencia Western y análisis del patrón de bandas generado.
