La secuenciación de la hebra de la plantilla de ADN de una sola célula , o Strand-seq , es una técnica para la secuenciación selectiva de las hebras de la plantilla parental de una célula hija. [1] Esta técnica ofrece una amplia variedad de aplicaciones, incluida la identificación de intercambios de cromátidas hermanas en la célula parental antes de la segregación, la evaluación de la segregación no aleatoria de cromátidas hermanas, la identificación de contigs desorientados en conjuntos de genomas , genoma de novo ensamblaje de ambos haplotipos en organismos diploides , incluidos humanos, haplotipado de cromosomas completosy la identificación de la variación estructural genómica somática y de la línea germinal , la última de las cuales puede detectarse de forma robusta incluso en células individuales.
Fondo
Strand-seq (secuenciación de una sola célula y de una sola hebra) fue uno de los primeros protocolos de secuenciación de una sola célula descritos en 2012. [1] Esta técnica genómica secuencia de forma selectiva las hebras de molde parentales en bibliotecas de ADN de células hijas individuales . [1] Como prueba de estudio de concepto, los autores demostraron la capacidad de adquirir información de secuencia de las hebras cromosómicas de Watson y / o Crick en una biblioteca de ADN individual, dependiendo del modo de segregación de cromátidas; una biblioteca de ADN típica siempre contendrá ADN de ambas cadenas. Los autores estaban específicamente interesados en mostrar la utilidad de strand-seq en la detección de intercambios de cromátidas hermanas (SCE) a alta resolución. Identificaron con éxito ocho SCE putativas en la línea celular de tallo embrionario (meS) murino (ratón) con una resolución de hasta 23 pb . También se ha demostrado que esta metodología tiene una gran utilidad para discernir patrones de segregación de cromátidas no aleatoria, especialmente en linajes de células madre. Además, las SCE se han implicado como indicadores de diagnóstico del estrés del genoma, información que tiene utilidad en la biología del cáncer. La mayoría de las investigaciones sobre este tema implican observar la variedad de hebras de plantilla cromosómica a través de muchos ciclos de desarrollo celular y correlacionar la variedad no aleatoria con destinos celulares particulares. Los protocolos de secuenciación unicelular fueron fundamentales en el desarrollo de esta técnica, pero difieren en varios aspectos.
Metodología
Métodos similares
Se han utilizado métodos anteriores para rastrear los patrones de herencia de las cromátidas por hebra y dilucidar el proceso de segregación no aleatoria:
Persecución de pulso
Se han utilizado experimentos de persecución de pulsos para determinar los patrones de segregación de los cromosomas, además de estudiar otros procesos celulares dependientes del tiempo. [2] Brevemente, los ensayos de persecución de pulsos permiten a los investigadores rastrear moléculas marcadas radiactivamente en la célula. En los experimentos utilizados para estudiar la variedad de cromosomas no aleatorios, las células madre se marcan o "pulsan" con un análogo de nucleótido que se incorpora en las hebras de ADN replicadas. [3] Esto permite rastrear los rodales nacientes a través de muchas rondas de replicación . Desafortunadamente, se encuentra que este método tiene una resolución deficiente, ya que solo se puede observar a nivel de cromátidas.
Hibridación in situ de fluorescencia con orientación cromosómica (CO-FISH)
CO-FISH, o hibridación in situ de fluorescencia específica de la hebra, facilita el direccionamiento específico de la hebra del ADN con sondas marcadas con fluorescencia. [4] Aprovecha la orientación uniforme de los satélites principales en relación con la dirección de los telómeros , lo que permite que las hebras se designen sin ambigüedades como hebras "Watson" o "Crick". Utilizando sondas unidireccionales que reconocen las principales regiones satélite, acopladas a colorantes marcados con fluorescencia, se pueden unir hebras individuales. [4] Para garantizar que solo se etiquete la hebra molde, las hebras recién formadas deben degradarse mediante la incorporación de BrdU y la fotólisis . Este protocolo ofrece una resolución citogenética mejorada, lo que permite a los investigadores observar hebras simples en lugar de cromátidas completas con experimentos de persecución de pulsos. Además, la segregación no aleatoria de cromátidas puede ensayarse directamente dirigiéndose a los principales marcadores satélites.
Protocolos de laboratorio húmedo
Las células de interés se cultivan in vivo o in vitro. Durante la fase S, las células se tratan con bromodesoxiuridina (BrdU) que luego se incorpora a su ADN naciente, actuando como un sustituto de la timidina. Después de que ha ocurrido al menos un evento de replicación, las células hijas se sincronizan en la fase G2 y se separan individualmente mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Las células se clasifican directamente en tampón de lisis y se extrae su ADN. Habiendo sido detenidos en un número específico de generaciones (generalmente una), se pueden evaluar los patrones de herencia de las cromátidas hermanas. Los siguientes métodos se concentran en la secuenciación del ADN del ADN de una sola célula hija. En este punto, los cromosomas están compuestos de hebras nacientes con BrdU en lugar de timidina y las hebras de plantilla originales se ceban para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN. Dado que este protocolo se publicó en 2012, [1] la metodología canónica solo está bien descrita para las plataformas de secuenciación de Illumina ; el protocolo podría adaptarse muy fácilmente a otras plataformas de secuenciación, dependiendo de la aplicación. A continuación, el ADN se incuba con un tinte especial de modo que cuando el complejo de tinte BrdU se excita con luz ultravioleta, las hebras nacientes se cortan mediante fotólisis . Este proceso inhibe la amplificación de la cadena naciente por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permitiendo que solo se amplifiquen las cadenas molde parentales. La construcción de la biblioteca procede de forma normal para la secuenciación de extremos emparejados de Illumina. A continuación, los cebadores de PCR multiplexados se ligan a los amplicones de PCR con códigos de barras hexámeros que identifican de qué célula se deriva cada fragmento. A diferencia de los protocolos de secuenciación de células individuales , Strand-seq no utiliza la amplificación de desplazamiento múltiple o MALBAC para la amplificación del ADN. Más bien, depende únicamente de la PCR.
Procesamiento bioinformático
La mayoría de las aplicaciones actuales de Strand-seq comienzan alineando las lecturas secuenciadas con un genoma de referencia. La alineación se puede realizar utilizando una variedad de alineadores de lectura corta como BWA y Bowtie. [5] [6] Al alinear las lecturas de Strand-seq de una sola célula con el genoma de referencia, se pueden determinar las hebras de plantilla heredadas. Si la célula se secuenció después de más de una generación, se puede determinar un patrón de surtido de cromátidas para el linaje celular particular en cuestión. El Análisis bioinformático de plantillas heredadas (BAIT) fue el primer software bioinformático que analizó exclusivamente las lecturas generadas a partir de la metodología Strand-seq. [7] Comienza alineando las lecturas con una secuencia de referencia, agrupando el genoma en secciones y, finalmente, contando el número de lecturas de Watson y Crick que caen dentro de cada intervalo. A partir de aquí, BAIT permite la identificación de eventos SCE, contigs desorientados en el genoma de referencia, cromosomas aneuploides y modos de segregación de cromátidas hermanas. También puede ayudar a ensamblar genomas de construcción temprana y asignar andamios huérfanos a ubicaciones dentro de genomas de construcción tardía. Después de BAIT, se han introducido recientemente numerosas herramientas bioinformáticas que utilizan datos de Strand-seq para una variedad de aplicaciones (ver, por ejemplo, las siguientes secciones sobre haplotipado, ensamblaje de novo del genoma y descubrimiento de variaciones estructurales en células individuales, con referencia a los respectivos artículos enlazados).
Limitaciones
Strand-seq requiere células que se someten a división celular para el marcaje con BrdU y, por lo tanto, no es aplicable a muestras fijadas con formalina o células que no se dividen. Pero se puede aplicar a células y tejidos mitóticos normales, organoides, así como a muestras de leucemia y tumores utilizando muestras primarias frescas o congeladas. Strand-seq está utilizando la secuenciación de Illumina, y las aplicaciones que requieren información de secuencia de diferentes tecnologías de secuenciación requieren nuevos protocolos o, alternativamente, la integración de datos generados mediante distintas plataformas de secuenciación, como se mostró recientemente. [8] [9]
Los autores de los artículos iniciales que describen Strand-seq demostraron que pudieron lograr una resolución de 23 pb para mapear SCE, y es probable que otras anomalías cromosómicas grandes compartan esta resolución de mapeo (si se realiza un mapeo fino de punto de ruptura). Sin embargo, la resolución depende de una combinación de la plataforma de secuenciación utilizada, los protocolos de preparación de la biblioteca y el número de células analizadas, así como la profundidad de la secuenciación por célula. Sin embargo, sería sensato que la precisión aumentara aún más con tecnologías de secuenciación que no incurran en errores en las repeticiones homopoliméricas.
Aplicaciones y utilidad
Identificación de intercambios de cromátidas hermanas
Strand-seq se propuso inicialmente como una herramienta para identificar los intercambios de cromátidas hermanas. [1] Al ser un proceso que se localiza en células individuales, la secuenciación del ADN de más de una célula dispersaría naturalmente estos efectos y sugeriría la ausencia de eventos SCE. Además, las técnicas clásicas de secuenciación unicelular no pueden mostrar estos eventos debido a los sesgos de amplificación heterogéneos y la información de secuencia de doble hebra, por lo que se necesita Strand-seq. Utilizando la información de alineación de referencia, los investigadores pueden identificar un SCE si cambia la direccionalidad de una hebra de plantilla heredada.
Identificar contigs desorientados
Los contigs desorientados están presentes en los genomas de referencia a tasas significativas (por ejemplo, 1% en el genoma de referencia del ratón). [1] [10] Strand-seq, a diferencia de los métodos de secuenciación convencionales, puede detectar estas desorientaciones. [1] Los contigs desorientados están presentes cuando la herencia de la hebra cambia de un estado homocigoto a otro (por ejemplo, WW a CC, o CC a WW). Además, este cambio de estado es visible en todas las bibliotecas de Strand-seq, lo que refuerza la presencia de un contig desorientado. [7]
Identificación de la segregación no aleatoria de cromátidas hermanas
Antes de la década de 1960, se suponía que las cromátidas hermanas se segregaban al azar en células hijas. Sin embargo, desde entonces se ha observado una segregación no aleatoria de cromátidas hermanas en células de mamíferos. [11] [12] Se han propuesto algunas hipótesis para explicar la segregación no aleatoria, incluyendo la Hipótesis de la Cadena Inmortal y la Hipótesis de la Hermana Silenciosa, una de las cuales se puede verificar con métodos que involucran a Strand-seq.
'' Hipótesis del hilo inmortal ''
Las mutaciones ocurren cada vez que una célula se divide. Ciertas células de larga vida (por ejemplo, células madre) pueden verse particularmente afectadas por estas mutaciones. La hipótesis de la hebra inmortal propone que estas células evitan la acumulación de mutaciones reteniendo sistemáticamente las hebras de la plantilla parental [9]. Para que esta hipótesis sea cierta, las cromátidas hermanas de todos y cada uno de los cromosomas deben segregarse de forma no aleatoria. Además, una celda retendrá exactamente el mismo conjunto de hebras de plantilla después de cada división, dando el resto a los otros productos celulares de la división. [13]
'' Hipótesis de la hermana silenciosa ''
Esta hipótesis establece que las cromátidas hermanas tienen diferentes firmas epigenéticas, por lo que también difieren en la regulación de la expresión. Cuando ocurre la replicación, la segregación no aleatoria de cromátidas hermanas asegura el destino de las células hijas. [14] Evaluar la validez de esta hipótesis requeriría un análisis conjunto de Strand-seq y perfiles de expresión génica para ambas células hijas. [13]
Descubrimiento de variaciones estructurales y cromosomas aneuploides
La salida de BAIT muestra la herencia de hebras de plantilla parentales a lo largo del genoma. [7] Normalmente, se heredan dos hebras de plantilla para cada autosoma, y cualquier desviación de este número indica un caso de aneuploidía , que se puede visualizar en células individuales.
Las inversiones son una clase de variación estructural equilibrada por número de copias , que conducen a un cambio en la direccionalidad de la hebra que Strand-seq visualiza fácilmente. Por lo tanto, Strand-seq puede usarse para detectar fácilmente inversiones polimórficas en humanos y primates, incluidos eventos del tamaño de Megbase incrustados en grandes duplicaciones segmentarias que se sabe que son inaccesibles para la secuenciación de Illumina . [15] [16]
Un estudio publicado en línea en 2019 demostró además que al usar Strand-seq, todas las clases de variación estructural ≥200kb, incluidas deleciones, duplicaciones, inversiones, duplicaciones invertidas, translocaciones equilibradas, translocaciones desequilibradas, reordenamientos complejos de ADN mediados por el ciclo de ruptura-fusión-puente y cromotripsis los eventos se detectan con sensibilidad en células individuales o subclones, utilizando procesamiento de tres canales de célula única (scTRIP). scTRIP funciona a través del modelado conjunto de orientación de lectura, profundidad de lectura y fase de haplotipo para descubrir SV en células individuales. [17] Utilizando scTRIP, las variantes estructurales se resuelven mediante un haplotipo de longitud de cromosoma que confiere una mayor sensibilidad y especificidad para la llamada de variantes estructurales unicelulares que otras tecnologías actuales. [17] Dado que scTRIP no requiere lecturas (o pares de lectura) que atraviesen los límites (o puntos de interrupción) de las variantes estructurales en células individuales para la llamada de variantes, no sufre de artefactos conocidos de métodos unicelulares basados en la amplificación del genoma completo (es decir, llamada quimera de lectura) que tienden a confundir el análisis de variación estructural en celdas individuales. [17]
Haplotipado, ensamblaje del genoma y generación de mapas de variación genética humana de alta resolución
Los genomas de construcción temprana están bastante fragmentados, con contigs desordenados y desorientados. El uso de Strand-seq proporciona información de direccionalidad para acompañar la secuencia, lo que finalmente ayuda a resolver la ubicación de los contigs. Contigs presentes en el mismo cromosoma exhibirán la misma direccionalidad, siempre que no hayan ocurrido eventos SCE. Por el contrario, los contigs presentes en diferentes cromosomas solo exhibirán la misma direccionalidad en el 50% de las bibliotecas de Strand-seq. [7] Los andamios, contigs sucesivos cruzados por un hueco, se pueden localizar de la misma manera. [7]
El mismo principio de usar la dirección de la hebra para distinguir moléculas de ADN grandes permite el uso de Strand-seq como una herramienta para construir haplotipos de variación genética de cromosomas completos, de telómero a telómero. [18]
Informes recientes han demostrado que Strand-seq se puede integrar computacionalmente con tecnología de secuenciación de lectura larga, con las ventajas únicas de ambas tecnologías que permiten la generación de conjuntos de genoma humano de novo altamente contiguos resueltos por haplotipos. [8] Estos ensamblajes genómicos integran todas las formas de variación genética, incluidas las variantes de un solo nucleótido, indeles y variación estructural incluso en loci genómicos complejos, y se han aplicado recientemente para generar mapas completos de variación estructural conscientes de haplotipos en un panel de diversidad de humanos de distintos ascendencias. [9]
Consideraciones
La posibilidad de que BrdU sea sustituida por timina en el ADN genómico podría inducir roturas cromosómicas bicatenarias y dar como resultado específicamente SCE se ha discutido previamente en la literatura. [19] [20] Además, se ha sugerido que la incorporación de BrdU interfiere con los patrones de segregación de cadenas. [13] Si este es el caso, habría una inflación en los SCE falsos positivos que pueden anotarse. Por lo tanto, muchas células deben analizarse utilizando el protocolo Strand-seq para asegurarse de que las SCE estén presentes de hecho en la población. Para las variantes estructurales detectadas en células individuales, la detección de la misma variante (en el mismo haplotipo) en más de una célula puede excluir la incorporación de BrdU como una posible causa. [17]
El número de cadenas de células individuales que deben secuenciarse para que se acepte una anotación aún no se ha propuesto y depende en gran medida de las preguntas que se hagan. Como Strand-seq se basa en técnicas de secuenciación unicelular, también se deben considerar los problemas que enfrenta la secuenciación unicelular. Estos incluyen los estándares que faltan para el aislamiento y la amplificación celular. A pesar de que estudios previos de Strand-seq aislaron células usando FACS, los microfluidos también sirven como una alternativa atractiva. Se ha demostrado que la PCR produce más productos de amplificación erróneos en comparación con los métodos basados en el desplazamiento de la hebra, como MDA y MALBAC, mientras que las dos últimas técnicas generan lecturas quiméricas como un subproducto que puede resultar en llamadas de variación estructural erróneas. [21] [17] MDA y MALBAC también generan más abandonos que Strand-seq durante la detección de SV porque requieren lecturas que cruzan el punto de interrupción de un SV para permitir su detección (esto no es necesario para ninguna de las diferentes clases de SV que Strand- seq puede detectar). [17] La amplificación por desplazamiento de hebras también tiende a generar más secuencia y productos más largos que podrían ser beneficiosos para las tecnologías de secuenciación de lectura prolongada.
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