En biología molecular , una biblioteca es una colección de fragmentos de ADN que se almacena y se propaga en una población de microorganismos mediante el proceso de clonación molecular . Existen diferentes tipos de bibliotecas de ADN, incluidas las bibliotecas de ADNc (formadas a partir de ARN transcrito de forma inversa ), las bibliotecas genómicas (formadas a partir de ADN genómico) y las bibliotecas mutantes aleatorias (formadas por síntesis de genes de novo donde se incorporan nucleótidos o codones alternativos). La tecnología de bibliotecas de ADN es un pilar de la biología molecular , la ingeniería genética y la ingeniería de proteínas actuales., y las aplicaciones de estas bibliotecas dependen de la fuente de los fragmentos de ADN originales. Existen diferencias en los vectores de clonación y las técnicas utilizadas en la preparación de bibliotecas, pero en general cada fragmento de ADN se inserta de forma única en un vector de clonación y el conjunto de moléculas de ADN recombinante se transfiere luego a una población de bacterias (un cromosoma artificial bacteriano o biblioteca BAC ) o levadura de manera que cada organismo contenga en promedio una construcción (vector + inserto). A medida que la población de organismos crece en cultivo, las moléculas de ADN contenidas en ellos se copian y propagan (por lo tanto, se "clonan").
Terminología
El término "biblioteca" puede referirse a una población de organismos, cada uno de los cuales lleva una molécula de ADN insertada en un vector de clonación, o alternativamente a la colección de todas las moléculas de vector clonadas.
bibliotecas de ADNc
Una biblioteca de ADNc representa una muestra del ARNm purificado de una fuente particular (ya sea una colección de células, un tejido particular o un organismo completo), que se ha convertido nuevamente en una plantilla de ADN mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa . Por lo tanto, representa los genes que se estaban transcribiendo activamente en esa fuente particular en las condiciones fisiológicas, de desarrollo o ambientales que existían cuando se purificó el ARNm. Se pueden generar bibliotecas de ADNc usando técnicas que promueven clones de "longitud completa" o en condiciones que generan fragmentos más cortos usados para la identificación de " etiquetas de secuencia expresadas ".
Las bibliotecas de ADNc son útiles en genética inversa, pero solo representan una porción muy pequeña (menos del 1%) del genoma general en un organismo dado.
Las aplicaciones de las bibliotecas de ADNc incluyen:
- Descubrimiento de genes nuevos
- Clonación de moléculas de ADNc de longitud completa para el estudio in vitro de la función genética
- Estudio del repertorio de ARNm expresados en diferentes células o tejidos
- Estudio de splicing alternativo en diferentes células o tejidos
Bibliotecas genómicas
Una biblioteca genómica es un conjunto de clones que juntos representan el genoma completo de un organismo determinado. El número de clones que constituyen una biblioteca genómica depende de (1) el tamaño del genoma en cuestión y (2) el tamaño del inserto tolerado por el sistema de vector de clonación particular . Para la mayoría de los propósitos prácticos, la fuente de tejido del ADN genómico no es importante porque cada célula del cuerpo contiene ADN virtualmente idéntico (con algunas excepciones).
Las aplicaciones de las bibliotecas genómicas incluyen:
- Determinación de la secuencia completa del genoma de un organismo determinado (ver proyecto genoma )
- Sirviendo como fuente de secuencia genómica para la generación de animales transgénicos mediante ingeniería genética
- Estudio de la función de secuencias reguladoras in vitro
- Estudio de mutaciones genéticas en tejidos cancerosos
Bibliotecas mutantes sintéticas
En contraste con los tipos de bibliotecas descritos anteriormente, existe una variedad de métodos artificiales para hacer bibliotecas de genes variantes. [1] La variación en todo el gen puede introducirse aleatoriamente mediante PCR propensa a errores , [2] mezcla de ADN para recombinar partes de genes similares, [3] o métodos basados en transposones para introducir indeles . [4] Como alternativa, las mutaciones pueden ser dirigidos a los codones específicos en la de novo síntesis o mutagénesis de saturación para la construcción de uno o más mutantes puntuales de un gen en una forma controlada. [5] Esto da como resultado una mezcla de moléculas de ADN de doble hebra que representan variantes del gen original.
Las proteínas expresadas a partir de estas bibliotecas se pueden cribar en busca de variantes que presenten propiedades favorables (por ejemplo, estabilidad, afinidad de unión o actividad enzimática). Esto se puede repetir en ciclos de creación de variantes genéticas y selección de productos de expresión en un proceso de evolución dirigida . [1]
Descripción general de las técnicas de preparación de bibliotecas de ADNc
Extracción de ADN
Si se crea una biblioteca de ARNm (es decir, con clones de ADNc), existen varios protocolos posibles para aislar ARNm de longitud completa. Para extraer ADN para bibliotecas de ADN genómico (también conocido como ADNg), puede ser útil una minipreparación de ADN.
Preparar insertos
Las bibliotecas de ADNc requieren cuidado para asegurar que los clones de ARNm de longitud completa se capturen como ADNc (que luego se insertará en los vectores). Se han diseñado varios protocolos para optimizar la síntesis de la 1ª hebra de cDNA y la 2ª hebra de cDNA por esta razón, y también para hacer más probable la clonación direccional en el vector.
Los fragmentos de ADNg se generan a partir del ADNg extraído mediante el uso de enzimas de restricción de corte frecuentes no específicas.
Vectores
Las secuencias de nucleótidos de interés se conservan como insertos en un plásmido o en el genoma de un bacteriófago que se ha utilizado para infectar células bacterianas.
Los vectores se propagan más comúnmente en células bacterianas, pero si se usa un YAC (cromosoma artificial de levadura), se pueden usar células de levadura. Los vectores también se pueden propagar en virus, pero esto puede llevar mucho tiempo y ser tedioso. Sin embargo, la alta eficacia de transfección lograda mediante el uso de virus (a menudo fagos) los hace útiles para empaquetar el vector (con el inserto ligado) y luego introducirlos en la célula bacteriana (o de levadura).
Además, para las bibliotecas de ADNc, se ha desarrollado un sistema que utiliza el fago Lambda Zap II, ExAssist y 2 especies de E. coli. En su lugar, también se puede usar un sistema Cre-Lox que usa sitios loxP y la expresión in vivo de la enzima recombinasa. Estos son ejemplos de sistemas de escisión in vivo. La escisión in vitro implica subclonación a menudo utilizando enzimas de restricción tradicionales y estrategias de clonación. La escisión in vitro puede llevar más tiempo y puede requerir más trabajo "práctico" que los sistemas de escisión in vivo. En cualquier caso, los sistemas permiten el movimiento del vector desde el fago a una célula viva, donde el vector puede replicarse y propagarse hasta que se vaya a utilizar la biblioteca.
Usar bibliotecas
Esto implica "cribado" de las secuencias de interés. Hay varios métodos posibles para lograrlo.
Referencias
- ^ a b Wajapeyee, Narendra; Liu, Alex Y .; Forloni, Matteo (1 de marzo de 2018). "Mutagénesis aleatoria mediante ADN polimerasas propensas a errores". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2018 (3): pdb.prot097741. doi : 10.1101 / pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . PMID 29496818 .
- ^ McCullum, Elizabeth O .; Williams, Berea AR; Zhang, Jinglei; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), "Mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores", Protocolos de mutagénesis in vitro: Tercera edición , Methods in Molecular Biology, Humana Press, 634 , págs. 103-109 , doi : 10.1007 / 978-1-60761-652-8_7 , ISBN 9781607616528, PMID 20676978
- ^ Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (enero de 1998). "La mezcla de ADN de una familia de genes de diversas especies acelera la evolución dirigida". Naturaleza . 391 (6664): 288–91. Código Bibliográfico : 1998Natur.391..288C . doi : 10.1038 / 34663 . PMID 9440693 .
- ^ Jones DD (mayo de 2005). "Eliminación de tripletes de nucleótidos en posiciones aleatorias en un gen diana: la tolerancia de TEM-1 beta-lactamasa a una deleción de aminoácidos" . Investigación de ácidos nucleicos . 33 (9): e80. doi : 10.1093 / nar / gni077 . PMC 1129029 . PMID 15897323 .
- ^ Wang, Tian-Wen; Zhu, Hu; Ma, Xing-Yuan; Zhang, Ting; Ma, Yu-Shu; Wei, Dong-Zhi (1 de septiembre de 2006). "Construcción de bibliotecas mutantes en evolución molecular dirigida". Biotecnología molecular . 34 (1): 55–68. doi : 10.1385 / MB: 34: 1: 55 . ISSN 1559-0305 . PMID 16943572 .