Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial
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Una descripción general del protocolo de selección in vitro. NA significa ácidos nucleicos ( ADN , ARN , PNA ) que comienzan como un grupo aleatorio y se enriquecen a través del proceso de selección.

La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial ( SELEX ), también conocida como selección in vitro o evolución in vitro , es una técnica de química combinatoria en biología molecular para producir oligonucleótidos de ADN monocatenario o ARN que se unen específicamente a un ligando o ligando diana. ligandos. Estos ADN o ARN monocatenarios se denominan comúnmente aptámeros . [1] [2] [3] Aunque SELEX ha surgido como el nombre más utilizado para el procedimiento, algunos investigadores se han referido a él comoSAAB (sitio de unión seleccionado y amplificado) y CASTing (amplificación cíclica y selección de dianas) [4] [5] SELEX se introdujo por primera vez en 1990. En 2015 se publicó un número especial en el Journal of Molecular Evolution en honor al cuarto de siglo del descubrimiento SELEX. [6]

El proceso comienza con la síntesis de una biblioteca de oligonucleótidos muy grande que consta de secuencias generadas aleatoriamente de longitud fija flanqueadas por extremos constantes 5 ' y 3' que sirven como cebadores . [2] Para una región generada aleatoriamente de longitud n , el número de posibles secuencias en la biblioteca es 4 n ( n posiciones con cuatro posibilidades (A, T, C, G) en cada posición). Las secuencias de la biblioteca se exponen al ligando diana, que puede ser una proteína o un pequeño compuesto orgánico , y las que no se unen a la diana se eliminan, generalmente mediante cromatografía de afinidad.o captura de diana en perlas paramagnéticas. [7] Las secuencias unidas se eluyen y amplifican mediante PCR [2] [3] para prepararse para rondas posteriores de selección en las que se puede aumentar el rigor de las condiciones de elución para identificar las secuencias de unión más estrictas. [2] Una precaución a considerar en este método es que la selección de entidades de afinidad de unión subnanomolar extremadamente alta puede no mejorar de hecho la especificidad para la molécula diana. [8] La unión fuera del objetivo a moléculas relacionadas podría tener efectos clínicos significativos.

SELEX se ha utilizado para desarrollar una serie de aptámeros que se unen a objetivos interesantes tanto para fines clínicos como de investigación. [9] También con estos fines, se han incorporado en las reacciones SELEX una serie de nucleótidos con azúcares y bases químicamente modificados. [9] [10] Estos nucleótidos modificados permiten la selección de aptámeros con nuevas propiedades de unión y una estabilidad potencialmente mejorada. [9] [10]

Procedimiento

Los aptámeros han surgido como una categoría novedosa en el campo de los biorreceptores debido a sus amplias aplicaciones que van desde la biosensibilidad hasta la terapéutica. Se han informado varias variaciones de su proceso de selección, llamado SELEX, que pueden producir secuencias con las propiedades deseadas necesarias para su uso final. [11]

Generación de una biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios

El primer paso de SELEX implica la síntesis de secuencias de oligonucleótidos total o parcialmente aleatorizadas de cierta longitud flanqueadas por regiones definidas que permiten la amplificación por PCR de esas regiones aleatorizadas y, en el caso de RNA SELEX, la transcripción in vitro de la secuencia aleatorizada. [2] [3] [12] Si bien Ellington y Szostak demostraron que la síntesis química es capaz de generar ~ 10 15 secuencias únicas para bibliotecas de oligonucleótidos en su artículo de 1990 sobre selección in vitro, [3] encontraron que la amplificación de estos oligonucleótidos sintetizados conducía a una pérdida significativa de diversidad de agrupaciones debido al sesgo de la PCR y defectos en los fragmentos sintetizados. [3]El conjunto de oligonucleótidos se amplifica y se agrega una cantidad suficiente de la biblioteca inicial a la reacción de modo que haya numerosas copias de cada secuencia individual para minimizar la pérdida de secuencias de unión potenciales debido a eventos estocásticos. [3] Antes de que la biblioteca se introduzca en la diana para la incubación y la retención selectiva, la biblioteca de secuencias debe convertirse en oligonucleótidos monocatenarios para lograr conformaciones estructurales con propiedades de unión a la diana. [2] [3]

Incubación de destino

Inmediatamente antes de la introducción de la diana, la biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios a menudo se calienta y enfría lentamente para renaturalizar los oligonucleótidos en estructuras secundarias y terciarias termodinámicamente estables. [3] [7] Una vez preparada, la biblioteca aleatorizada se incuba con una diana inmovilizada para permitir la unión entre el oligonucleótido y la diana. Hay varias consideraciones para este paso de incubación de la diana, incluido el método de inmovilización de la diana y las estrategias para la posterior separación de oligonucleótidos no unidos, el tiempo y la temperatura de incubación, las condiciones del tampón de incubación y las concentraciones de diana frente a oligonucleótidos. Ejemplos de métodos de inmovilización de diana incluyen columnas de cromatografía de afinidad , [3] nitrocelulosafiltros de ensayo de unión , [2] y perlas paramagnéticas. [7] Recientemente, se han desarrollado reacciones SELEX donde el objetivo son las células completas, que se expanden cerca de la confluencia completa y se incuban con la biblioteca de oligonucleótidos en placas de cultivo. [13] Las condiciones del tampón de incubación se modifican en función del objetivo previsto y la función deseada del aptámero seleccionado. Por ejemplo, en el caso de pequeñas moléculas y proteínas cargadas negativamente, se utilizan tampones con alto contenido de sal para la detección de cargas para permitir que los nucleótidos se acerquen al objetivo y aumentar la posibilidad de un evento de unión específico. [3]Alternativamente, si la función del aptámero deseada es la unión de proteína in vivo o de células completas para una posible aplicación terapéutica o de diagnóstico, es más probable que las condiciones de tampón de incubación similares a las concentraciones de sal plasmática in vivo y las temperaturas homeostáticas generen aptámeros que puedan unirse in vivo. Otra consideración en las condiciones del tampón de incubación son los competidores no específicos. Si existe una alta probabilidad de retención de oligonucleótidos inespecíficos en las condiciones de reacción, se pueden usar competidores no específicos, que son moléculas pequeñas o polímeros distintos de la biblioteca SELEX que tienen propiedades físicas similares a las de la biblioteca de oligonucleótidos, para ocupar estos no- sitios de unión específicos. [13]La variación de la concentración relativa de diana y oligonucleótidos también puede afectar las propiedades de los aptámeros seleccionados. Si una buena afinidad de unión por el aptámero seleccionado no es un problema, entonces se puede usar un exceso de diana para aumentar la probabilidad de que al menos algunas secuencias se unan durante la incubación y se retengan. Sin embargo, esto no proporciona una presión selectiva para una alta afinidad de unión , lo que requiere que la biblioteca de oligonucleótidos esté en exceso para que exista competencia entre secuencias únicas por los sitios de unión específicos disponibles. [2]

Elución y amplificación de la secuencia de unión

Una vez que la biblioteca de oligonucleótidos se ha incubado con la diana durante el tiempo suficiente, los oligonucleótidos no unidos se eliminan por lavado de la diana inmovilizada, a menudo usando el tampón de incubación de modo que se retengan los oligonucleótidos unidos específicamente. [3] Con las secuencias no unidas eliminadas, las secuencias unidas específicamente se eluyen creando condiciones de desnaturalización que promueven el despliegue de oligonucleótidos o la pérdida de la conformación de la unión, incluido el fluir en agua desionizada, [3] utilizando soluciones desnaturalizantes que contienen urea y EDTA, [13] [ 14] o aplicando mucho calor y fuerza física. [7] Tras la elución de las secuencias unidas, los oligonucleótidos retenidos se transcriben de forma inversa.al ADN en el caso de ARN o selecciones de bases modificadas, [2] [3] [13] o simplemente recolectadas para amplificación en el caso de ADN SELEX. [15] Estos moldes de ADN de las secuencias eluidas se amplifican luego mediante PCR y se convierten en oligonucleótidos de una sola hebra, ARN o de base modificada, que se utilizan como entrada inicial para la siguiente ronda de selección. [2] [3]

Obtención de ssDNA

Uno de los pasos más críticos en el procedimiento SELEX es obtener ADN monocatenario (ssDNA) después del paso de amplificación por PCR. Esto servirá como entrada para el próximo ciclo, por lo que es de vital importancia que todo el ADN sea monocatenario y se pierda la menor cantidad posible. Debido a la relativa simplicidad, uno de los métodos más utilizados es el uso de cebadores inversos biotinilados en la etapa de amplificación, después de lo cual las hebras complementarias se pueden unir a una resina seguida de elución de la otra hebra con lejía. Otro método es la PCR asimétrica, donde la etapa de amplificación se realiza con un exceso de cebador directo y muy poco cebador inverso, lo que conduce a la producción de más de la hebra deseada.Un inconveniente de este método es que el producto debe purificarse a partir de ADN bicatenario (dsDNA) y otro material sobrante de la reacción de PCR. La degradación enzimática de la hebra no deseada se puede realizar marcando esta hebra con un cebador con sonda de fosfato, ya que es reconocido por enzimas comoExonucleasa lambda . A continuación, estas enzimas degradan selectivamente la hebra marcada con fosfato dejando intacta la hebra complementaria. Todos estos métodos recuperan aproximadamente del 50 al 70% del ADN. Para una comparación detallada, consulte el artículo de Svobodová et al. donde estos y otros métodos se comparan experimentalmente. [16] En el SELEX clásico, el proceso de generación aleatoria de bibliotecas monocatenarias, incubación de la diana y elución y amplificación de la secuencia de unión descritos anteriormente se repiten hasta que la gran mayoría del grupo retenido consta de secuencias de unión a la diana, [2] [3] aunque hay modificaciones y adiciones al procedimiento que se utilizan con frecuencia, que se analizan a continuación.

Selección negativa o de contador

Para aumentar la especificidad de los aptámeros seleccionados mediante un procedimiento SELEX dado, se puede añadir una etapa de selección negativa o contraselección antes o inmediatamente después de la incubación de la diana. Para eliminar las secuencias con afinidad por los componentes de la matriz de inmovilización de la diana del conjunto, se puede usar la selección negativa cuando la biblioteca se incubó con los componentes de la matriz de inmovilización de la diana y se retienen las secuencias no unidas. [14] [17] [15] La selección negativa también se puede usar para eliminar secuencias que se unen a moléculas o células similares a la diana incubando la biblioteca de oligonucleótidos con análogos de la diana de moléculas pequeñas, tipos de células no deseadas o proteínas no diana y reteniendo las secuencias. [13] [15] [18]

Seguimiento de la progresión de la selección

Para seguir el progreso de una reacción SELEX, el número de moléculas unidas a la diana, que es equivalente al número de oligonucleótidos eluidos, se puede comparar con la entrada total estimada de oligonucleótidos después de la elución en cada ronda. [3] [19] El número de oligonucleótidos eluidos puede estimarse mediante estimaciones de concentración de elución mediante absorbancia de longitud de onda de 260 nm [19] o marcaje fluorescente de oligonucleótidos. [7] A medida que la reacción SELEX se acerca a su finalización, la fracción de la biblioteca de oligonucleótidos que se une a la diana se acerca al 100%, de modo que el número de moléculas eluidas se acerca al total estimado de entrada de oligonucleótidos, pero puede converger en un número menor. [3]

Advertencias y consideraciones

Algunas reacciones SELEX pueden generar sondas que dependen de las regiones de unión del cebador para la formación de estructuras secundarias. [7] Hay aplicaciones de aptámeros para las que es deseable una secuencia corta y, por lo tanto, el truncamiento del cebador. [20] Un avance en el método original permite que una biblioteca de ARN omita las regiones de cebadores constantes, que pueden ser difíciles de eliminar después del proceso de selección porque estabilizan estructuras secundarias que son inestables cuando se forman solo por la región aleatoria. [21]

Nucleótidos químicamente modificados

Recientemente, SELEX se ha expandido para incluir el uso de nucleótidos modificados químicamente. Estos oligonucleótidos modificados químicamente ofrecen muchas ventajas potenciales para aptámeros seleccionados, incluida una mayor estabilidad y resistencia a las nucleasas, unión mejorada para objetivos seleccionados, propiedades físicas expandidas, como una mayor hidrofobicidad y conformaciones estructurales más diversas. [9] [10] [22]

El alfabeto genético, y por lo tanto los posibles aptámeros, también se amplía utilizando pares de bases no naturales [23] [24]. El uso de estos pares de bases no naturales se aplicó a SELEX y se generaron aptámeros de ADN de alta afinidad. [25]

Objetivos anteriores

La técnica se ha utilizado para desarrollar aptámeros de afinidad de unión extremadamente alta a una variedad de ligandos diana, incluidas moléculas pequeñas como ATP [26] y adenosina [12] [27] y proteínas como priones [28] y factor de crecimiento endotelial vascular. (VEGF). [29] Además, SELEX se ha utilizado para seleccionar aptámeros de alta afinidad para dianas complejas como las células tumorales. [30] Los aptámeros que se unen a marcadores tumorales sugieren usos clínicos de la técnica , [31] fluoróforos relacionados con GFP , [32]y la FDA ha aprobado un aptámero de unión a VEGF, denominado Macugen, para el tratamiento de la degeneración macular . [29] [33] Además, SELEX se ha utilizado para obtener ADN o ADNzimas catalíticos altamente específicos. Se han informado varias ADNzimas específicas de metales, incluida la ADNzima GR-5 (específica de plomo), [34] las ADNzimas CA1-3 (específicas de cobre), [35] la ADNzima 39E (específica de uranilo) [36] y la ADNzima NaA43 (específica de sodio). [37]

Estos aptámeros desarrollados han visto diversas aplicaciones en terapias para la degeneración macular [33] y diversas aplicaciones de investigación, incluidos biosensores , [20] marcaje fluorescente de proteínas [38] y células, [39] e inhibición selectiva de enzimas. [40]

Ver también

  • Aptamer
  • Desoxirribozima
  • Aptámeros antitrombina
  • Sistema de un híbrido bacteriano

Referencias

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Otras lecturas

  • Levine HA, Nilsen-Hamilton M (febrero de 2007). "Un análisis matemático de SELEX" . Biología y Química Computacional . 31 (1): 11–35. doi : 10.1016 / j.compbiolchem.2006.10.002 . PMC  2374838 . PMID  17218151 .
  • Derrame F, Weinstein ZB, Irani Shemirani A, Ho N, Desai D, Zaman MH (octubre de 2016). "Controlar la incertidumbre en la selección de aptámeros" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 113 (43): 12076–12081. arXiv : 1612.08995 . Código Bib : 2016PNAS..11312076S . doi : 10.1073 / pnas.1605086113 . PMC  5087011 . PMID  27790993 .

enlaces externos

  • Base de aptámero
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