Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción ( TALEN ) son enzimas de restricción que pueden diseñarse para cortar secuencias específicas de ADN. Se fabrican fusionando un dominio de unión al ADN efector de TAL con un dominio de escisión del ADN (una nucleasa que corta las hebras de ADN). Los efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) pueden diseñarse para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada, por lo que cuando se combinan con una nucleasa, el ADN se puede cortar en ubicaciones específicas. [1] Las enzimas de restricción se pueden introducir en las células, para su uso en la edición de genes o para la edición del genoma in situ , una técnica conocida comoedición del genoma con nucleasas modificadas genéticamente . Junto con las nucleasas de dedos de zinc y CRISPR / Cas9 , TALEN es una herramienta destacada en el campo de la edición del genoma .
Dominio de unión al ADN de TALE
Los efectores de TAL son proteínas secretadas por la bacteria Xanthomonas a través de su sistema de secreción de tipo III cuando infectan plantas . [2] El dominio de unión al ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos altamente conservada con 12º y 13º aminoácidos divergentes. Estas dos posiciones, denominadas Diresidue variable de repetición (RVD), son muy variables y muestran una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos . [3] [4] Esta relación directa entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN ha permitido la ingeniería de dominios de unión a ADN específicos mediante la selección de una combinación de segmentos repetidos que contienen los RVD apropiados. [1] En particular, los cambios leves en el RVD y la incorporación de secuencias de RVD "no convencionales" pueden mejorar la especificidad del objetivo. [5]
Dominio de escisión de ADN
El dominio de escisión de ADN no específico del extremo de la endonucleasa FokI puede usarse para construir nucleasas híbridas que son activas en un ensayo de levadura. [6] [7] Estos reactivos también son activos en células vegetales [8] [9] y en células animales. [9] [10] [11] [12] Los estudios iniciales de TALEN utilizaron el dominio de escisión de FokI de tipo salvaje, pero algunos estudios posteriores de TALEN [11] [13] [14] también utilizaron variantes del dominio de escisión de FokI con mutaciones diseñadas para mejorar la escisión especificidad [15] [16] y actividad de escisión. [17] El dominio FokI funciona como un dímero, requiriendo dos construcciones con dominios de unión de ADN únicos para sitios en el genoma objetivo con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión al ADN de TALE y el dominio de escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. [10] [18]
Ingeniería TALEN construye
La simple relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN del dominio de unión TALE permite la ingeniería eficiente de proteínas. En este caso, la síntesis de genes artificiales es problemática debido al apareamiento inadecuado de la secuencia repetitiva que se encuentra en el dominio de unión de TALE. [19] Una solución a esto es utilizar un programa de software disponible públicamente (DNAWorks [20] ) para calcular oligonucleótidos adecuados para el ensamblaje en un ensamblaje de oligonucleótidos de PCR de dos pasos seguido de amplificación de genes completos. También se han informado varios esquemas de ensamblaje modular para generar construcciones TALE diseñadas. [9] [19] [21] [22] [23] [24] Ambos métodos ofrecen un enfoque sistemático para diseñar dominios de unión al ADN que es conceptualmente similar al método de ensamblaje modular para generar dominios de reconocimiento de ADN con dedos de zinc .
Transfección
Una vez que se han ensamblado las construcciones de TALEN, se insertan en plásmidos ; A continuación, las células diana se transfectan con los plásmidos y los productos génicos se expresan y entran en el núcleo para acceder al genoma. Alternativamente, las construcciones de TALEN se pueden administrar a las células como ARNm, lo que elimina la posibilidad de integración genómica de la proteína que expresa TALEN. El uso de un vector de ARNm también puede aumentar drásticamente el nivel de reparación dirigida por homología (HDR) y el éxito de la introgresión durante la edición de genes.
Edición del genoma
Mecanismos
TALEN se puede utilizar para editar genomas induciendo roturas de doble cadena (DSB), a las que las células responden con mecanismos de reparación.
La unión de extremos no homólogos (NHEJ) liga directamente el ADN de cualquier lado de una rotura de doble hebra donde hay muy poca o ninguna superposición de secuencia para el apareamiento. Este mecanismo de reparación induce errores en el genoma a través de indeles (inserción o deleción) o reordenamiento cromosómico; Cualquiera de estos errores puede hacer que los productos genéticos codificados en esa ubicación no sean funcionales. [10] Debido a que esta actividad puede variar según la especie, el tipo de célula, el gen diana y la nucleasa utilizada, se debe monitorear al diseñar nuevos sistemas. Se puede realizar un ensayo de escisión de heterodúplex simple que detecta cualquier diferencia entre dos alelos amplificados por PCR. Los productos de escisión se pueden visualizar en geles de agarosa simples o sistemas de gel en placa.
Alternativamente, el ADN se puede introducir en un genoma a través de NHEJ en presencia de fragmentos de ADN de doble hebra exógenos. [10]
La reparación dirigida por homología también puede introducir ADN extraño en el DSB, ya que las secuencias de doble hebra transfectadas se utilizan como moldes para las enzimas de reparación. [10]
Aplicaciones
TALEN se ha utilizado para modificar eficazmente los genomas de las plantas, [25] creando cultivos alimentarios de importancia económica con cualidades nutricionales favorables. [26] También se han aprovechado para desarrollar herramientas para la producción de biocombustibles . [27] Además, se ha utilizado para diseñar clones de células madre embrionarias humanas modificadas de forma estable y células madre pluripotentes inducidas (IPSC) y líneas celulares eritroides humanas, [11] [28] para generar C. elegans knockout , [12] knockout ratas , [13] ratones knockout, [29] y pez cebra knockout . [14] [30] Además, el método se puede utilizar para generar organismos knockin. Wu et al. Obtuvieron un ganado sp110 knockin usando talen ninasas para inducir una mayor resistencia a la tuberculosis. [31] Este enfoque también se ha utilizado para generar ratas knockin mediante microinyección de ARNm de TALEN en embriones unicelulares. [32]
TALEN también se ha utilizado experimentalmente para corregir los errores genéticos que subyacen a la enfermedad. [33] Por ejemplo, se ha utilizado in vitro para corregir los defectos genéticos que causan trastornos como la anemia de células falciformes , [28] [34] xeroderma pigmentosum , [35] y epidermólisis ampollosa . [36] Recientemente, se demostró que TALEN puede usarse como herramientas para aprovechar el sistema inmunológico para combatir el cáncer; El direccionamiento mediado por TALEN puede generar células T que son resistentes a los fármacos quimioterapéuticos y muestran actividad antitumoral. [37] [38]
En teoría, la especificidad de todo el genoma de las fusiones de TALEN diseñadas permite la corrección de errores en los loci genéticos individuales mediante la reparación dirigida por homología a partir de una plantilla exógena correcta. [33] En realidad, sin embargo, la aplicación in situ de TALEN está actualmente limitada por la falta de un mecanismo de administración eficiente, factores inmunogénicos desconocidos y la incertidumbre en la especificidad de la unión de TALEN. [33]
Otra aplicación emergente de TALEN es su capacidad para combinarse con otras herramientas de ingeniería del genoma, como las meganucleasas . La región de unión al ADN de un efector TAL se puede combinar con el dominio de escisión de una meganucleasa para crear una arquitectura híbrida que combine la facilidad de ingeniería y la actividad de unión al ADN altamente específica de un efector TAL con la baja frecuencia y especificidad del sitio de una meganucleasa. [39]
En comparación con otras técnicas de edición del genoma, TALEN se ubica en el medio en términos de dificultad y costo. A diferencia de las ZFN , TALEN reconoce nucleótidos individuales. Es mucho más sencillo diseñar interacciones entre los dominios de unión al ADN de TALEN y sus nucleótidos diana que crear interacciones con ZNF y sus tripletes de nucleótidos diana. [40] Por otro lado, CRISPR se basa en la formación de complejos de ribonucleótidos en lugar del reconocimiento de proteínas / ADN. Los ARNg pueden dirigirse a casi cualquier secuencia del genoma y pueden producirse de forma económica, lo que hace que CRISPR sea más eficiente y menos costoso que TALEN y ZFN. TALEN es, en última instancia, 200 veces más caro que CRISPR y tarda varios meses más en realizarse.
Precisión de nucleasa efectora TAL
La actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa puede conducir a roturas indeseadas de la doble cadena y, en consecuencia, puede producir reordenamientos cromosómicos y / o muerte celular. Se han realizado estudios para comparar la toxicidad relativa asociada a las nucleasas de las tecnologías disponibles. Sobre la base de estos estudios [18] y la distancia teórica máxima entre la unión al ADN y la actividad nucleasa, se cree que las construcciones de TALEN tienen la mayor precisión de las tecnologías actualmente disponibles. [41]
Ver también
- Edición del genoma con nucleasas diseñadas
- Nucleasa de dedos de zinc
- Meganucleasa
- CRISPR
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enlaces externos
- E-TALEN.org Una herramienta integral para el diseño de TALEN
- Molécula de PDB del mes Una entrada en el destacado estructural mensual de la base de datos de proteínas