La termolisina ( EC 3.4.24.27 , Bacillus thermoproteolyticus proteinasa neutra , termoasa , termoasa Y10 , TLN ) es un termoestable neutral metaloproteinasa enzima producida por el Gram-positivas bacterias Bacillus thermoproteolyticus . [2] Requiere un ion zinc para la actividad enzimática y cuatro iones calcio para la estabilidad estructural. [3] La termolisina cataliza específicamente la hidrólisis de enlaces peptídicos que contienenaminoácidos hidrofóbicos . Sin embargo, la termolisina también se usa ampliamente para la formación de enlaces peptídicos a través de la reacción inversa de la hidrólisis. [4] La termolisina es el miembro más estable de una familia de metaloproteinasas producidas por varias especies de Bacillus . Estas enzimas también se denominan proteinasas "neutras" o proteinasas de tipo termolisina (TLP).
Termolisina | ||||||||
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![]() Estructura cristalográfica de Bacillus thermoproteolyticus thermolysin. [1] | ||||||||
Identificadores | ||||||||
CE no. | 3.4.24.27 | |||||||
No CAS. | 9073-78-3 | |||||||
Bases de datos | ||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | |||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | |||||||
FÁCIL | NiceZyme vista | |||||||
KEGG | Entrada KEGG | |||||||
MetaCyc | camino metabólico | |||||||
PRIAM | perfil | |||||||
Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
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Síntesis
Como todas las proteasas extracelulares bacterianas, la termolisina es sintetizada primero por la bacteria como preproenzima . [5] La termolisina se sintetiza como una preproenzima que consta de un péptido señal de 28 aminoácidos de longitud, un propéptido de 204 aminoácidos de longitud y la propia enzima madura de 316 aminoácidos de longitud. El péptido señal actúa como señal para la translocación de preprotermolisina a la membrana citoplasmática bacteriana . En el periplasma, la preprotermolisina se procesa luego en protermolisina mediante una peptidasa señal . La prosecuencia actúa luego como una chaperona molecular y conduce a la autoclasificación del enlace peptídico que une las secuencias pro y maduras. Luego, la proteína madura se secreta al medio extracelular. [6]
Estructura
La termolisina tiene un peso molecular de 34.600 Da. Su estructura general consta de dos dominios aproximadamente esféricos con una hendidura profunda que atraviesa el centro de la molécula que separa los dos dominios. La estructura secundaria de cada dominio es bastante diferente, el dominio N-terminal consiste principalmente en una hoja plegada beta , mientras que el dominio C-terminal es principalmente de estructura alfa helicoidal . Estos dos dominios están conectados por una hélice alfa central, que abarca los aminoácidos 137-151. [7]
A diferencia de muchas proteínas que experimentan cambios conformacionales tras el calentamiento y la desnaturalización , la termolisina no experimenta cambios conformacionales importantes hasta al menos 70 ° C. [8] La estabilidad térmica de los miembros de la familia TLP se mide en términos de una temperatura T 50 . A esta temperatura, la incubación durante 30 minutos reduce la actividad de las enzimas a la mitad. La termolisina tiene un valor de T 50 de 86,9 ° C, lo que la convierte en el miembro más termoestable de la familia TLP. [9] Los estudios sobre la contribución del calcio a la estabilidad de la termolisina han demostrado que tras la inactivación térmica se libera un solo ión calcio de la molécula. [10] Evitar que este calcio se una originalmente a la molécula por mutación de su sitio de unión, redujo la estabilidad de la termolisina en 7 ° C. Sin embargo, mientras que la unión del calcio hace una contribución significativa a la estabilización de la termolisina, más crucial para la estabilidad es un pequeño grupo de aminoácidos del dominio N-terminal ubicado en la superficie de las proteínas. [9] En particular, una fenilalanina (F) en la posición del aminoácido 63 y una prolina (P) en la posición del aminoácido 69 contribuyen significativamente a la estabilidad de la termolisina. Cambiar estos aminoácidos a treonina (T) y alanina (A) respectivamente en una proteinasa similar a la termolisina menos estable producida por Bacillus stearothermophillus (TLP-ste), da como resultado reducciones individuales en la estabilidad de 7 ° C (F63 → T) y 6,3 ° C (P69 → A) y cuando se combina una reducción de la estabilidad de 12,3 ° C. [9]
Aplicaciones
- En la síntesis de aspartamo , se produce un subproducto de sabor menos amargo cuando la reacción es catalizada por termolisina. [11]
- Determinación de la estabilidad de la proteína en el lisado celular mediante el ensayo de proteólisis rápida paralela (FASTpp) . [12]
Referencias
- ^ PDB : 3TMN ; Holden HM, Matthews BW (marzo de 1988). "La unión de L-valil-L-triptófano a termolisina cristalina ilustra el modo de interacción de un producto de hidrólisis de péptidos". J. Biol. Chem . 263 (7): 3256–60. PMID 3343246 .
- ^ Endo, S. (1962). "Estudios sobre proteasa producida por bacterias termofílicas". J. Ferment. Technol . 40 : 346–353.
- ^ Tajima M, Urabe I y col. (1976). "Papel de los iones calcio en la termoestabilidad de la termolisina y la proteasa neutra de Bacillus subtilis var. Amylosacchariticus". EUR. J. Biochem . 64 (1): 243–247. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1976.tb10293.x . PMID 819262 .
- ^ Trusek-Holownia A. (2003). "Síntesis de ZAlaPheOMe, el precursor del dipéptido amargo en el sistema de agua-acetato de etilo de dos fases catalizado por termolisina". J. Biotechnol . 102 (2): 153-163. doi : 10.1016 / S0168-1656 (03) 00024-5 . PMID 12697393 .
- ^ Yasukawa K, Kusano M, Inouye K (2007). "Un nuevo método para la producción extracelular de termolisina recombinante mediante la coexpresión de la secuencia madura y pro-secuencia en Escherichia coli" . Protein Eng. Des. Sel . 20 (8): 375–383. doi : 10.1093 / protein / gzm031 . PMID 17616558 .
- ^ Inouye K, Kusano M y col. (2007). Ingeniería, expresión, purificación y producción de termolisina recombinante . Biotechnol. Annu. Rev . Revisión anual de biotecnología. 13 . págs. 43–64. doi : 10.1016 / S1387-2656 (07) 13003-9 . ISBN 978-0-444-53032-5. PMID 17875473 .
- ^ Holmes MA, Matthews BW (1982). "Estructura de termolisina refinada a una resolución de 1,6 A". J. Mol. Biol . 160 (4): 623–639. doi : 10.1016 / 0022-2836 (82) 90319-9 . PMID 7175940 .
- ^ Matthews BW, Weaver LH, Kester WR (1974). "La conformación de la termolisina". J. Biol. Chem . 249 (24): 8030–8044. PMID 4214815 .
- ^ a b c Eijsink VG, Veltman OR y col. (1995). "Determinantes estructurales de la estabilidad de proteinasas similares a termolisina". Nat. Struct. Biol . 2 (5): 374–379. doi : 10.1038 / nsb0595-374 . PMID 7664094 .
- ^ Dahlquist FW, Long JW, Bigbee WL (1976). "Papel del calcio en la estabilidad térmica de la termolisina". Bioquímica . 15 (5): 1103-1111. doi : 10.1021 / bi00650a024 . PMID 814920 .
- ^ Yagasaki, Makoto; Hashimoto, Shin-ichi (noviembre de 2008). "Síntesis y aplicación de dipéptidos; estado actual y perspectivas". Microbiología y Biotecnología Aplicadas . 81 (1): 13-22. doi : 10.1007 / s00253-008-1590-3 . PMID 18795289 .
- ^ Minde, David P .; Maurice, Madelon M .; Rüdiger, Stefan GD (2012). "Determinación de la estabilidad de proteínas biofísicas en lisados mediante un ensayo de proteólisis rápida, FASTpp" . PLOS ONE . 7 (10): e46147. doi : 10.1371 / journal.pone.0046147 . PMC 3463568 . PMID 23056252 .
enlaces externos
- La base de datos en línea MEROPS para peptidasas y sus inhibidores: M04.001
- Thermolysin en la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU. Encabezados de temas médicos (MeSH)