Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción ( TALEN ) son enzimas de restricción que pueden diseñarse para cortar secuencias específicas de ADN. Se fabrican fusionando un dominio de unión al ADN efector de TAL con un dominio de escisión del ADN (una nucleasa que corta las cadenas de ADN). Los efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) se pueden diseñar para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada, por lo que cuando se combinan con una nucleasa, el ADN se puede cortar en ubicaciones específicas. [1] Las enzimas de restricción se pueden introducir en las células, para su uso en la edición de genes o para la edición del genoma in situ , una técnica conocida comoedición del genoma con nucleasas modificadas genéticamente . Junto con las nucleasas de dedos de zinc y CRISPR / Cas9 , TALEN es una herramienta destacada en el campo de la edición del genoma .
Los efectores de TAL son proteínas secretadas por la bacteria Xanthomonas a través de su sistema de secreción de tipo III cuando infectan plantas . [2] El dominio de unión al ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos altamente conservada con aminoácidos duodécimo y decimotercero divergentes. Estas dos posiciones, denominadas Diresidue variable de repetición (RVD), son muy variables y muestran una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos . [3] [4] Esta relación directa entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN ha permitido la ingeniería de dominios de unión a ADN específicos mediante la selección de una combinación de segmentos repetidos que contienen los RVD apropiados. [1] En particular, los cambios leves en el RVD y la incorporación de secuencias de RVD "no convencionales" pueden mejorar la especificidad de la focalización. [5]
El dominio de escisión de ADN no específico del extremo de la endonucleasa FokI puede usarse para construir nucleasas híbridas que son activas en un ensayo de levadura. [6] [7] Estos reactivos también son activos en células vegetales [8] [9] y en células animales. [9] [10] [11] [12] Los estudios iniciales de TALEN utilizaron el dominio de escisión de FokI de tipo salvaje, pero algunos estudios posteriores de TALEN [11] [13] [14] también utilizaron variantes del dominio de escisión de FokI con mutaciones diseñadas para mejorar la escisión especificidad [15] [16] y actividad de escisión. [17]El dominio FokI funciona como un dímero, requiriendo dos construcciones con dominios de unión de ADN únicos para sitios en el genoma diana con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión al ADN de TALE y el dominio de escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. [10] [18]
La simple relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento del ADN del dominio de unión de TALE permite la ingeniería eficiente de proteínas. En este caso, la síntesis de genes artificiales es problemática debido al apareamiento inadecuado de la secuencia repetitiva que se encuentra en el dominio de unión de TALE. [19] Una solución a esto es utilizar un programa de software disponible públicamente (DNAWorks [20] ) para calcular los oligonucleótidos adecuados para el ensamblaje en un ensamblaje de oligonucleótidos de PCR de dos pasos seguido de la amplificación del gen completo. También se han informado varios esquemas de ensamblaje modular para generar construcciones TALE diseñadas. [9] [19] [21] [22][23] [24] Ambos métodos ofrecen un enfoque sistemático para diseñar dominios de unión al ADN que es conceptualmente similar al método de ensamblaje modular para generardominios de reconocimiento de ADN con dedos de zinc .
Una vez que se han ensamblado las construcciones de TALEN, se insertan en plásmidos ; las células diana luego se transfectan con los plásmidos y los productos génicos se expresan y entran en el núcleo para acceder al genoma. Alternativamente, las construcciones de TALEN se pueden administrar a las células como ARNm, lo que elimina la posibilidad de integración genómica de la proteína que expresa TALEN. El uso de un vector de ARNm también puede aumentar drásticamente el nivel de reparación dirigida por homología (HDR) y el éxito de la introgresión durante la edición de genes.
TALEN se puede utilizar para editar genomas induciendo roturas de doble cadena (DSB), a las que las células responden con mecanismos de reparación.