Zymoblot es la microtécnica disponible más rápida para detectar la expresión génica o la actividad enzimática en cualquier muestra biológica. La técnica fue inventada por el profesor Elsayed Elsayed Wagih en colaboración con la profesora Jacqueline Fletcher del Departamento de Patología Vegetal, Centro de Investigación Noble , Universidad Estatal de Oklahoma , EE. UU. en 1993. [1]
Los fenómenos fisiológicos, ya sea a nivel celular o molecular en los organismos vivos, son impulsados directa o indirectamente por reacciones enzimáticas . Por lo tanto, el ensayo de actividades enzimáticas en organismos vivos es una de las actividades más comúnmente realizadas en los laboratorios de fisiología modernos. Numerosos métodos de ensayos enzimáticos están disponibles para seguir cuantitativamente las reacciones enzimáticas. Estos métodos que se han agrupado en seis categorías, a saber, espectrofotométrico , fluorescencia , nanométrico , electrodo , polarimétrico , [2] radiobioquímico [3]no tienen inconvenientes. Recientemente, se introdujo una nueva microtécnica cualitativa o más bien semicuantitativa, descrita por primera vez por Wagih y Fletcher (1993), [1] y denominada 'zymoblot' para detectar actividades enzimáticas en espiroplasmas y bacterias y muchos otros sistemas biológicos . [4] [5] Posteriormente, la técnica se hizo cuantitativa por densitometría y se usó con éxito para monitorear la actividad de la peroxidasa en plantas infectadas con virus . [6]
Tan solo 1 µl, o menos, de una muestra es suficiente para detectar la actividad enzimática mediante la técnica de zymoblot, ya que el producto coloreado es insoluble y se acumula en un área confinada sobre el sitio de la mancha. Las otras técnicas, basadas en la colorimetría , pueden requerir alícuotas más grandes de una muestra para que la cantidad de productos solubles coloreados producidos sea lo suficientemente grande como para colorear el contenido de la cubeta de ensayo a un nivel colorimétricamente legible.
La técnica tiene ventajas que no comparte ninguna otra técnica. Las muestras que se van a analizar con zymoblot no requieren diálisis (un proceso que puede llevar días), ya que el lavado de las manchas en solución salina tamponada con Tris (TBS) antes de marinarlas en la mezcla de reacción elimina los inhibidores . A diferencia de otras técnicas en las que las muestras se analizan individualmente, las muestras que se analizarán mediante zymoblot se colocan en la misma transferencia y la actividad enzimática se analiza con la misma mezcla de reacción al mismo tiempo, lo que minimiza los errores experimentales y permite comparaciones cualitativas rápidas. Además, se pueden analizar varias enzimas en un orden secuencial .en la misma mancha. Es decir, si un blot resulta negativo para una determinada enzima, se puede lavar en TBS y reutilizar para otra enzima y así sucesivamente hasta obtener una reacción positiva para una enzima. A diferencia de los ensayos húmedos (p. ej., colorimetría), los resultados obtenidos por el zymoblot siempre están registrados. Esto permite realizar zimotransferencias en un lugar, donde es posible que no se disponga de un densitómetro , y llevarlas o enviarlas a otro lugar para analizarlas cuantitativamente mediante densitometría. Llevar un zymoblot en la billetera de un investigador a una reunión facilita las discusiones y el intercambio de ideas con otros científicos. Mientras que los ensayos enzimáticos de base inmunológica [3] que utilizan anticuerpos específicos de enzimaspara detectar enzimas directamente tiene la gran desventaja de medir el "contenido total de enzimas" y no la actividad enzimática total, zymoblot, al no ser una técnica serológica , no utiliza anticuerpos y mide la actividad enzimática, ya que detecta solo la porción activa (funcional) de el contenido total de enzimas en una muestra.