La adenilación , [1] [2] más comúnmente conocida como AMPilación , es un proceso en el que una molécula de monofosfato de adenosina (AMP) se une covalentemente a la cadena lateral de aminoácidos de una proteína . [3] Esta adición covalente de AMP a una cadena lateral de hidroxilo de la proteína es una modificación postraduccional . [4] La adenililación implica un enlace fosfodiéster entre un grupo hidroxilo de la molécula que se somete a la adenilación y el grupo fosfato del nucleótido monofosfato de adenosina (es decir, ácido adenílico). Enzimas que son capaces de catalizar este proceso se llaman AMPylators.
Los aminoácidos conocidos a los que se dirige la proteína son la tirosina y la treonina y, a veces, la serina. [5] Cuando las cargas de una proteína experimentan un cambio, afecta las características de la proteína, normalmente alterando su forma a través de interacciones de los aminoácidos que la componen. La AMPilación puede tener varios efectos sobre la proteína. Estas son propiedades de la proteína, estabilidad, actividad enzimática, unión de cofactor y muchas otras capacidades funcionales de una proteína. Otra función de la adenililación es la activación de los aminoácidos, que es catalizada por la aminoacil sintetasa del ARNt. [3] Las proteínas identificadas con mayor frecuencia para recibir AMPilación son las GTPasas y la glutamina sintetasa .
AMPilación y AMPiladores
Enzimas responsables de AMPylation, llamados AMPylators o adeniltransferasa , se dividen en dos familias diferentes, todo dependiendo de sus propiedades estructurales y mecanismos utilizados. AMPylator se crea mediante dos mitades catalíticas homólogas. La mitad es responsable de catalizar la reacción de adenilación, mientras que la otra mitad cataliza la reacción de desadenilación fosforolítica [2] . Estas dos familias son la ADN- β -polimerasa similar y la familia Fic. [6]
Similar a la ADN- β -polimerasa, es una familia de nucleotidiltransferasas . [4] Más específicamente se conoce como la familia GlnE. Hay un motivo específico que se utiliza para aclarar esta familia en particular. El motivo consiste en una hoja β de tres hebras que forma parte de la coordinación de iones de magnesio y la unión de fosfato. El aspartato es fundamental para que la actividad se produzca en esta familia.
El dominio Fic pertenece a la superfamilia Fido (Fic / Doc) . Se sabe que la familia Fic , que es una filamentación inducida por el dominio AMP cíclico, realiza AMPilación. Esta familia de proteínas se encuentra en todos los dominios de la vida en la tierra. Está mediado por un mecanismo de motivo de hélice alfa del sitio de unión de ATP. Las bacterias infecciosas utilizan este dominio para interrumpir la fagocitosis y causar la muerte celular. Los dominios fic son dominios conservados evolutivamente en procariotas y eucariotas que pertenecen a la superfamilia de dominios Fido. [4]
Se ha demostrado que los AMPiladores son comparables a las quinasas debido a su actividad de hidrólisis de ATP y transferencia reversible del metabolito a una cadena lateral hidroxilo del sustrato proteico. Sin embargo, la AMPilación realiza un ataque nucleofílico en el grupo α-fosfato, mientras que la quinasa en la reacción de fosforilación se dirige al γ-fosfato. El ataque nucleofílico de la AMPilación conduce a la liberación de pirofosfato y modificación de AMP. [5]
Desamipilación
La des-AMPilación es la reacción inversa en la que una molécula de AMP se separa del lado del aminoácido de una proteína de cadena.
GS-ATase (GlnE) es un AMPylator que se ha demostrado que cataliza la des-AMPilación de la glutamina sintetasa al eliminar el enlace covalente entre AMP y un residuo hidroxilo de una proteína. Contiene dos dominios de adenilil transferasa regulados por P II y sus modificaciones postraduccionales asociadas. La des-AMPilación de la glutamina sintetasa es causada por la fosforilación del enlace adenil-tirosina usando ortofosfato , lo que lleva a la creación de ADP y glutamina sintetasa no modificada. [4] La des-AMPilación se produce en el extremo N-terminal del dominio.
Regulaciones en AMPilación y Desamilación
P II es la proteína reguladora que controla la especificidad de los AMPilatores para regular la AMPilación y Desamilación. P II es la proteína trimérica. Hay dos formas de P II , incluidas P II sin modificar y P II - UMP. P II se une a AMPylator cataliza la unión de AMP a la enzima postraduccional, como uno de los ejemplos famosos es la glutamina sintetasa (GS-ATasa). Cuando los niveles de nitrógeno son altos, P II interactúa con GS-ATasa para inducir AMPilación. GS-ATasa La AMPilación de la glutamina sintetasa se produce en el sitio de la tirosina 397, lo que provoca la terminación de la síntesis de glutamina. En niveles bajos de nitrógeno, P II se somete a UMPilación y la proteína P II UMPilada inhibe la GS-ATasa, provocando que la GS-ATasa sea des-AMPilada. Una vez que esto ocurre, tiene lugar la síntesis de glutamina. [7]
AMPilación en procariotas
Homeostasis bacteriana
La AMPilación está involucrada en la homeostasis bacteriana. El ejemplo más famoso es AMPylator GS-ATase (GlnE), que contribuye en la regulación compleja del metabolismo del nitrógeno a través de la AMPilación de la glutamina sintetasa que se introdujo en las partes de AMPilación y DeAMPilación.
Otro ejemplo de AMPylators que juegan un papel en la homeostasis bacteriana son los Fic AMPylators de clase I (FicT), que modifica la subunidad GyrB de la ADN girasa, el residuo de tirosina conservado para la unión de ATP de la subunidad ParE en la topoisomerasa IV. Esta inactivación de la ADN girasa por AMPilación conduce a la activación de la respuesta SOS, que es la respuesta celular al daño del ADN. La actividad de FicT AMPilación es reversible y solo conduce a la detención del crecimiento, pero no a la muerte celular. Por lo tanto, la AMPilación de FicT juega un papel en la regulación del estrés celular, que se muestra en la bacteria Wolbachia que el nivel de FicT aumenta en respuesta a la doxiciclina.
También se encuentra que un NmFic de AMPylator Fic Clase III de N. meningtidis modifica AMPylate GyrB en la tirosina conservada para la unión de ATP. Esto muestra que los dominios Fic están muy conservados, lo que indica el importante papel de la AMPilación en la regulación del estrés celular en las bacterias. La regulación de NmFic implica la monomerización y autoAMPilación dependientes de la concentración para la activación de la actividad de NmFic. [5]
Patogenicidad bacteriana
Se ha demostrado que las proteínas bacterianas, también conocidas como efectoras, usan AMPilación. Se ha demostrado que los efectores como VopS, IbpA y DrrA AMPilan las GTPasas del hospedador y provocan cambios en el citoesqueleto de actina. Las GTPasas son objetivos comunes de AMPylators. Las familias Rho , Rab y Arf GTPasa están involucradas en la dinámica del citoesqueleto de actina y el tráfico vesicular. También juegan un papel en los mecanismos de control celular como la fagocitosis en la célula huésped.
El patógeno mejora o previene su internalización induciendo o inhibiendo la fagocitosis de la célula huésped [4] . Vibrio parahaemolyticus es una bacteria gramnegativa que causa intoxicación alimentaria como resultado del consumo de mariscos crudos o poco cocidos en humanos. [8] VopS, un efector de tipo III que se encuentra en Vibrio parahaemolyticus , contiene un dominio Fic que tiene un motivo HPFx (D / E) GN (G / K) R conservado que contiene un residuo de histidina esencial para la AMPilación. VopS bloquea el ensamblaje de actina modificando el residuo de treonina en la región del conmutador 1 de Rho GTPasas. La transferencia de un resto de AMP usando ATP al residuo de treonina da como resultado un impedimento estérico y, por lo tanto, evita que las Rho GTPasas interactúen con los efectores posteriores. VopS también adenila RhoA y el ciclo de división celular 42 (CDC42), lo que lleva a una desagregación de la red de filamentos de actina. [3] [5] Como resultado, el control del citoesqueleto de actina de la célula huésped se desactiva, lo que lleva al redondeo celular. [4] [8]
La IbpA se secreta en células eucariotas de H. somni , una bacteria gramnegativa en el ganado que causa infección del epitelio respiratorio. Este efector contiene dos dominios Fic en la región C-terminal. La AMPilación del dominio IbpA Fic de las GTPasas de la familia Rho es responsable de su citotoxicidad. Ambos dominios Fic tienen efectos similares sobre el citoesqueleto de las células huésped como VopS. [3] [5] La AMPilación en un residuo de tirosina de la región del interruptor 1 bloquea la interacción de las GTPasas con sustratos aguas abajo como PAK.
DrrA es el sustrato del sistema de translocación Dot / Icm tipo IV DrrA de Legionella pneumophila . Es el efector secretado por L. pneumophila para modificar las GTPasas de las células huésped. Esta modificación aumenta la supervivencia de las bacterias en las células huésped. DrrA se compone de un dominio de factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) específico de Rab1b , un dominio de unión a lípidos C-terminal y un dominio N-terminal con propiedades citotóxicas poco claras. Los trabajos de investigación muestran que DrrA N-terminal y de longitud completa muestra actividad de AMPylators hacia la proteína Rab1b del huésped (proteína relacionada con Ras), que también es el sustrato del dominio Rab1b GEF. La proteína Rab1b es la GTPasa Rab para regular el transporte de vesículas y la fusión de membranas. La adenilación por las bacterias AMPylators prolonga el estado de unión a GTP de Rab1b. Por lo tanto, el papel del efector DrrA está relacionado con los beneficios de las vacuolas de las bacterias para su replicación durante la infección. [3] [5]
AMPilación en eucariotas
La mayor parte de la investigación sobre la AMPilación de proteínas endógenas en eucariotas se ha centrado en la proteína E asociada a Huntingtin (HypE) en humanos, CG9523 en Drosophila melanogaster y Fic-1 en C. elegans . La mayoría de los metazoos contienen solo un dominio fic en su genoma y, según el análisis filogenético, el dominio se desarrolló de forma independiente o se adquirió a través de eventos de transferencia genética horizontal . A pesar de esto, sus estructuras son similares: contienen un N-terminal seguido de (generalmente dos) repeticiones tetratricopeptídicas (TPR), que están unidas a un dominio C-fic por cuatro hélices α centrales. [9]
CG9523 en Drosophila melanogaster
CG9523 es una transmembrana tipo II residente en el retículo endoplásmico (RE). Se N-glicosila en Asn288, se procesa proteolíticamente y luego se secreta a través de la vía secretora del RE a la superficie celular de las proyecciones del cuerpo humano, un sitio putativo de reciclaje de neurotransmisores. Se descubrió que las moscas ciegas que no pueden recibir estimulación luminosa de las neuronas fotosinápticas responden a la luz una vez más una vez que se activa la expresión genética de un fic de tipo salvaje, lo que indica que la AMPilación podría desempeñar un papel en el reciclaje de neurotransmisores. [9]
Los estudios in vitro muestran que la AMPilación también puede bloquear Grp78 (una proteína chaperona de choque térmico residente en ER) en un estado inactivo bajo estrés al alterar su dominio ATPasa, evitando el cambio estructural requerido para el plegamiento de proteínas. Sin embargo, esto no es un cambio estructural permanente, ya que la AMPilación de Grp78 es reversible y puede des-AMPilarse a demanda para apoyar el plegamiento de proteínas dentro del retículo endoplásmico. [10]
HypE (FICD) en Homo sapiens
La proteína E asociada a la huntingtina (HypE) se identificó como una AMPilasa en 2009. [11] La HypE es una AMPilasa residente en el RE que se encuentra predominantemente en el continuo de la envoltura nuclear del RE con la estructura general de una proteína de membrana de tipo II y está N-glicosilada en Asn275. Consiste en una única α-hélice que une los dominios fic y TPR, que están formados por múltiples α-hélices. La actividad de HypE es óptima en presencia de Mn 2+ y Mg 2+ , mientras que los niveles altos de Ca 2+ se correlacionan con un aumento en los niveles de ATP dentro del retículo endoplásmico, creando condiciones favorables para que HypE AMPylate sus objetivos.
HypE y UPR ER
UPR ER consta de tres componentes: IRE1 , ATF6 y PERK . Estos tres normalmente están unidos por Grp78 y se vuelven inactivos, pero se activan en momentos de estrés ER cuando Grp78 se convierte en proteínas mal plegadas. La activación de UPR ER da como resultado una reducción de la síntesis de proteínas , una reducción de la carga de proteínas que ingresa al RE y la inducción de un programa transcripcional que aumenta la capacidad del RE para resolver el estrés. [12]
Las tasas de supervivencia celular disminuyen bajo estrés ER cuando se libera UPR ER y HypE está inactivo, mientras que la sobreexpresión de HypE es citotóxica y conduce a apoptosis dependiente de caspasa . Se ha demostrado que HypE regula UPR ER mediante la modificación de Grp78, aunque los sitios de modificación y los efectos de las modificaciones de Grp78 aún no se han confirmado. Se han propuesto dos teorías:
- La AMPilación de Grp78 es una modificación activadora inducida por el estrés del RE. La actividad de la ATPasa se ve reforzada por la AMPilación mediada por HypE, pero no hay ningún efecto sobre la unión de Grp78 en las proteínas desnaturalizadas. El estrés ER aumenta los niveles de HypE, provocando la inducción de vías dependientes de ATF6 y PERK. [9]
- La AMPilación de Grp78 es una modificación inactivante que mantiene un grupo de Grp78 fácilmente accesible pero inactivo cuando hay un estrés de ER bajo. En épocas de alto estrés en el RE, la AMPilación de Grp78 aumenta después de que se establece la proteostasis. Como resultado, los niveles bajos de HypE dan como resultado niveles elevados de Grp78 en el RE, aumentando la capacidad tampón del RE para hacer frente a una mayor carga de proteínas desplegadas y atenuando la inducción de UPR. [9]
HypE y enfermedad de Parkinson
Se encontró que la proteína presináptica α-sinucleína es un objetivo para HypE. Durante la adenilación de αSyn mediada por HypE , la agregación de αSyn disminuye y se descubrió que tanto la neurotoxicidad como el estrés ER disminuyen in vitro . Por tanto, la adenilación de αSyn es posiblemente una respuesta protectora al estrés ER y la agregación de αSyn. Sin embargo, es necesario realizar más investigaciones para descubrir si este proceso es independiente o si la adenilación se produce en respuesta al estrés del RE. [13]
Fic-1 en Caenorhabditis elegans
Fic-1 es la única proteína Fic presente en el código genético de C. elegans . Se encuentra principalmente en la envoltura nuclear del RE de células adultas de la línea germinal y células embrionarias, pero también se pueden encontrar pequeñas cantidades dentro del citoplasma. Es responsable de la AMPilación de las histonas centrales y los factores de traducción de tipo eEF1-A dentro del nematodo. [14]
Aunque los niveles variables de AMPilación no crearon ningún efecto notable dentro del comportamiento o fisiología del nematodo, los gusanos knockout Fic-1 fueron más susceptibles a la infección por Pseudomonas aeruginosa en comparación con las contrapartes con dominios Fic-1 activos, lo que implica un vínculo entre AMPilación de objetivos celulares y respuestas inmunes dentro de los nematodos. [9]
Métodos para detectar proteínas AMPiladas
Mangos químicos
Los mangos químicos se utilizan para detectar proteínas modificadas postraduccionalmente. Recientemente, existe un N6pATP que contiene una etiqueta de alquinilo (propargilo) en la posición N6 de la adenina de ATP. Este N6pATP se combina con la reacción de clic para detectar proteínas AMPiladas. Para detectar proteínas modificadas no reconocidas y marcar sustratos de VopS, se utilizan derivados de ATP con un fluoróforo en la adenina N6 NH2 para hacer eso. [5] [6]
Método basado en anticuerpos
El anticuerpo es famoso por su alta afinidad y selectividad, por lo que es la buena forma de detectar proteínas AMPiladas. Recientemente, los anticuerpos ɑ-AMP se utilizan para detectar y aislar directamente proteínas AMPiladas (especialmente tirosina AMPilada y treonina AMPilada) de células y lisados celulares. La AMPilación es una modificación postraduccional, por lo que modificará las propiedades de la proteína dando el carácter polar de AMP y la hidrofobicidad. Por tanto, en lugar de utilizar anticuerpos que detectan una secuencia de péptidos completa, se prefiere la producción de anticuerpos AMP dirigidos directamente a aminoácidos específicos. [5] [6]
Espectrometría de masas
Anteriormente, muchos trabajos científicos usaban espectrometría de masas (MS) en diferentes modos de fragmentación para detectar péptidos AMPylated. En respuesta a las técnicas de fragmentación distintivas, las secuencias de proteínas AMPiladas se desintegraron en diferentes partes de AMP. Mientras que la disociación por transferencia de electrones (ETD) crea fragmentos mínimos y espectros menos complicados, la disociación inducida por colisión (CID) y la fragmentación por colisión de alta energía (HCD) generan iones característicos adecuados para la identificación de proteínas AMPiladas al generar múltiples fragmentos de AMP. Debido a la estabilidad de AMP, los espectros de fragmentación de péptidos son fáciles de leer manualmente o con motores de búsqueda. [5] [6]
Inhibición de moléculas pequeñas de AMPilatores
Thompson y colaboradores encontraron recientemente el primer inhibidor de la AMPilación de proteínas. [15] Se cree que esto es una forma eficaz de vencer las infecciones. El inhibidor tiene una constante inhibidora (Ki) que varía entre 6 y 50 µM y una selectividad de al menos 30 veces frente a HypE. [5] [6]
Referencias
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