El nucleótido aminoalilo es un nucleótido con una base modificada que contiene una alilamina . Se utilizan en el posetiquetado de ácidos nucleicos mediante detección de fluorescencia en microarrays . Son reactivos con el grupo éster de N-hidroxisuccinimida que ayuda a unir un tinte fluorescente al grupo amino primario en el nucleótido. Estos nucleótidos se conocen como 5- (3-amino alil ) -nucleótidos ya que el grupo aminoalilo normalmente está unido al carbono 5 del anillo de pirimidina de uracilo o citosina . El grupo amina primaria en el resto aminoalilo esalifáticos y, por tanto, más reactivos en comparación con los grupos amina que están directamente unidos a los anillos ( aromáticos ) de las bases. Los nombres comunes de nucleósidos de aminoalilo se abrevian inicialmente con aa- o AA- para indicar aminoalilo. El azúcar de 5 carbonos se indica con o sin la "d" minúscula que indica desoxirribosa si está incluida o ribosa si no. Finalmente, se indican la base nitrogenada y el número de fosfatos (es decir, aa-UTP = trifosfato de aminoalil uridina ).
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Historia
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El objetivo de combinar la fluorescencia y los ácidos nucleicos ha sido proporcionar una etiqueta no isotópica que sea detectable para estudiar el ADN o el ARN . Este tipo de etiquetado permite a los científicos estudiar el ADN o el ARN en su estructura, función o formación con otros ácidos nucleicos. [2] La primera modificación de base para el marcaje fluorescente ocurrió en 1971 con una 4-tiouridina y 4-tiouracilo . [3] Esta investigación junto con otras, que incluyeron varios tipos de marcaje directo y no directo a través de: análogos , adición a través de enzimas u otros métodos, hicieron que el marcaje de nucleótidos fuera mucho más seguro para que los científicos estudiaran el ADN. [2]
A medida que la instrumentación y las tecnologías se vuelven más avanzadas en el campo de los microarrays de ADN , se necesitarán mejores reactivos y técnicas para realizar más estudios científicos. Se demostró que el marcaje fluorescente con Cy3 era más insuficiente y sesgaba los resultados; en su lugar, se optó por el método de incorporación de nucleótidos aminoalilo. El uso de nucleótidos aminoalilo como marcaje fluorescente indirecto pareció anular los problemas de sensibilidad observados en el marcaje con cianina . [4]
Síntesis
Los nucleósidos de aminoalilo se pueden sintetizar mediante el acoplamiento de Heck como se muestra en la imagen a continuación. [5]
En la imagen de arriba, a la izquierda hay un nucleósido modificado con un yodo (el yodo se agrega mediante halogenación electrofílica ) en el quinto carbono en el anillo de pirimidina. Su formación se puede asociar con una reacción con una alilamina y varios reactivos a través del acoplamiento de heck son capaces de eliminar el grupo halógeno de la base y agregar la alilamina para convertirse en el nucleósido aminoalilo que se muestra a la derecha. [5] El producto de la derecha se utiliza luego en biología molecular en la síntesis de ARN. [4] [6] [7]
Otras reacciones incluyen el uso de síntesis en un solo recipiente con otros halógenos . [8]
Reacción
La amina primaria en el nucleótido de aminoalilo reacciona con tintes reactivos con amino [9] como una cianina y tintes patentados [10] [11] que contienen un grupo saliente reactivo, como un éster de succinimidilo ( NHS ). Los grupos amina unidos directamente al anillo de la base no se ven afectados. Estos nucleótidos se utilizan para marcar el ADN. [4] [6] [10] [11] [12]
Usos
Los NTP de aminoalilo se utilizan para el marcaje indirecto de ADN en PCR , traducción de muescas , extensiones de cebadores y síntesis de ADNc . [13] Estos NTP etiquetados son útiles debido a su aplicación en laboratorios de biología molecular donde no tienen la capacidad para manipular material radiactivo. Por ejemplo, la 5- (3-Aminoalil) -Uridina (AA-UTP) son más eficaces para el etiquetado de ADN de alta densidad que el etiquetado previo del ADN. Después de la adición enzimática de los NTP, se pueden agregar tintes fluorescentes reactivos de amina para la detección de la molécula de ADN. [7] Cuando se incorpora a moléculas de ADN o ARN mediante la ADN / ARN polimerasa , la 5- (3-aminoalil) -UTP proporciona un grupo reactivo para la adición de otros grupos químicos. Por tanto, el ADN o ARN modificado con aminoalilo se puede marcar con cualquier compuesto que tenga un grupo reactivo con amina. Los aa-NTP incorporados en ADN / ARN en combinación con reactivos de acoplamiento de un colorante secundario pueden sondear para un análisis de matriz. [6]
El ADNc se basa en el marcaje con aminoalilo para fines de detección. Aunque el marcaje directo de dNTP es el método más rápido y económico de marcaje fluorescente, es desventajoso ya que la secuencia permite solo un nucleótido modificado para su uso. Otra desventaja del marcaje directo son los nucleótidos voluminosos, sin embargo, esto puede superarse mediante el marcaje indirecto utilizando nucleótidos modificados con aminoalilo. [14] Una manera fácil de verificar el éxito del etiquetado es el color; un buen etiquetado dará como resultado un color azul (Cy5) o rojo (Cy3) visible en el material final. [15]
Otro proceso que utiliza el marcaje con aminoalilo es NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos), una técnica muy sensible para amplificar ARN. En este caso específico, los ARN modificados de aaUTP se marcaron con el mercado fluorescente Cy3. NASBA combinado con el etiquetado de aminoalil-UTP es muy útil para muchas áreas diferentes de diagnóstico microbiano, incluida la monitorización ambiental, la detección de amenazas biológicas, la monitorización de procesos industriales y la microbiología clínica. [16] La micromatriz de ADN es otro método que utiliza específicamente AA-NTP, lo que hace que las pruebas de micromatriz de ADN sean más rápidas y económicas. [12]
El etiquetado posterior a la síntesis evita los problemas encontrados en la incorporación enzimática directa de dNTP marcados con Cy al generar sondas con la misma eficacia de etiquetado. Con el marcaje indirecto, los NTP modificados con amina se incorporan durante la transcripción inversa , la amplificación del ARN o la PCR . Los amino alil-NTP se incorporan con una eficacia similar a los NTP no modificados durante la polimerización. [17] [18]
Preocupaciones con el etiquetado: El grupo amina, en el nucleótido modificado con aminoalilo, es reactivo con colorantes como la serie de cianina u otros colorantes patentados. Surge un problema cuando los colorantes reaccionan con agentes tamponantes que son necesarios para el almacenamiento adecuado de los nucleótidos. Sin embargo, se puede utilizar un tampón de carbonato para superar este problema. [19]
Ver también
- NASBA
- PCR
- Traducción de Nick
- ADNc
- Microarray
- Fluoróforo
- Transcripción inversa
Referencias
- ^ Hogan, Daniel J .; Riordan, Daniel P .; Gerber, André P .; Herschlag, Daniel; Brown, Patrick O. (2008). "Diversas proteínas de unión a ARN interactúan con conjuntos de ARN relacionados funcionalmente, lo que sugiere un amplio sistema regulador" . PLOS Biología . 6 (10): e255. doi : 10.1371 / journal.pbio.0060255 . PMC 2573929 . PMID 18959479 .
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enlaces externos
- El protocolo de ejemplo de Holly Bennet y Joe DeRisi se originó en Rosetta Informatics modificado por Chris Seidel. [1]
- ^ Seidel, Chris. "Preparación de la sonda fluorescente" . Consultado el 24 de marzo de 2014 .