La complementación de fluorescencia bimolecular (también conocida como BiFC ) es una tecnología que se usa típicamente para validar interacciones de proteínas . Se basa en la asociación de fragmentos de proteínas fluorescentes que se unen a componentes del mismo complejo macromolecular . Las proteínas que se postula que interactúan se fusionan con fragmentos complementarios desplegados de una proteína indicadora fluorescente y se expresan en células vivas. La interacción de estas proteínas acercará los fragmentos fluorescentes, lo que permitirá que la proteína informadora se reforme en su estructura tridimensional nativa y emita su señal fluorescente. [1]Esta señal fluorescente se puede detectar y ubicar dentro de la célula utilizando un microscopio de fluorescencia invertido que permite obtener imágenes de fluorescencia en las células. Además, la intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional a la fuerza de la interacción, con niveles más fuertes de fluorescencia que indican interacciones cercanas o directas y niveles más bajos de fluorescencia que sugieren interacción dentro de un complejo. [2] Por lo tanto, a través de la visualización y el análisis de la intensidad y distribución de la fluorescencia en estas células, se puede identificar tanto la ubicación como los socios de interacción de las proteínas de interés.
Historia
La complementación bioquímica se informó por primera vez en ribonucleasa pancreática bovina escindida con subtilisina , luego se expandió usando mutantes de β-galactosidasa que permitieron que las células crecieran en lactosa. [3] [4] [5]
El reconocimiento de la capacidad de muchas proteínas para ensamblarse espontáneamente en complejos funcionales, así como la capacidad de los fragmentos de proteínas para ensamblarse como consecuencia del ensamblaje del complejo funcional espontáneo de los socios de interacción a los que se fusionan, se informó más tarde para los fragmentos de ubiquitina en las interacciones de proteínas de levadura. [6]
En 2000, Ghosh et al desarrollaron un sistema que permitió reensamblar una proteína verde fluorescente ( GFP ) utilizando una cremallera de leucina antiparalela en células de E. coli . [7] Esto se logró mediante la disección de GFP en fragmentos de GFP C- y N-terminales . Como el fragmento de GFP se unió a cada cremallera de leucina mediante un enlazador, la heterodimerización de la cremallera de leucina antiparalela dio como resultado una proteína GFP reconstituida o reformada que podía visualizarse. La señal fluorescente exitosa indicó que los fragmentos de péptidos de GFP separados pudieron reensamblarse correctamente y lograr el plegamiento terciario . Por lo tanto, se postuló que con esta técnica, la GFP fragmentada podría usarse para estudiar la interacción de pares proteína-proteína que tienen sus extremos N-C muy próximos.
Después de la demostración de la reconstitución exitosa del fragmento de proteína fluorescente en células de mamífero, Hu et al . describieron el uso de la proteína fluorescente amarilla fragmentada ( YFP ) en la investigación de las interacciones de los factores de transcripción de la familia Rel y bZIP . [8] Este fue el primer informe sobre la regulación de la interacción de la proteína bZIP por regiones fuera del dominio bZIP , la regulación de la localización subnuclear de los dominios bZIP Fos y Jun por sus diferentes socios interactuantes, y la modulación de la activación transcripcional de las proteínas bZIP y Rel a través de interacciones mutuas. . Además, este estudio fue el primer informe de una técnica in vivo , ahora conocida como el ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), para proporcionar información sobre la base estructural de la formación de complejos proteicos mediante la detección de la fluorescencia causada por el ensamblaje de la proteína informadora fluorescente. fragmentos atados a proteínas que interactúan. [8]
Etiquetado fluorescente
La activación del fluoróforo ocurre a través de una reacción de ciclación autocatalítica que ocurre después de que la proteína se ha plegado correctamente. [9] Esto se avanzó con la reconstitución exitosa del fluoróforo YFP a partir de fragmentos de proteínas que se habían fusionado con proteínas que interactuaban dentro de las 8 horas posteriores a la transfección, informado en 2002. [8]
Flujo de trabajo
Selección del sistema de producción de proteínas de fusión.
Existen diferentes sistemas de producción que se pueden utilizar para la proteína de fusión generada. La expresión génica transitoria se utiliza para identificar interacciones proteína-proteína in vivo , así como en la localización subcelular del complejo BiFC. Sin embargo, se debe tener cuidado con la sobreexpresión de proteínas, ya que esto puede sesgar tanto la localización preferencial como los complejos de proteínas predominantes formados. En cambio, los promotores débiles , el uso de niveles bajos de ADN plasmídico en la transfección y los vectores plasmídicos que no se replican en células de mamíferos deben usarse para expresar proteínas en o cerca de sus niveles endógenos para imitar el entorno celular fisiológico. [10] Además, la selección cuidadosa de la proteína fluorescente es importante, ya que diferentes proteínas fluorescentes requieren diferentes entornos celulares. Por ejemplo, GFP se puede usar en células de E. coli , mientras que YFP se usa en células de mamíferos. [11]
Las líneas celulares estables con el vector de expresión integrado en su genoma permiten una expresión génica más estable en la población celular, lo que da como resultado resultados más consistentes. [1]
Determinación de sitios de fusión.
Al decidir el sitio de fusión del enlazador en la superficie de la proteína, hay tres consideraciones principales. Primero, los fragmentos de proteínas fluorescentes deben poder asociarse entre sí cuando interactúan sus proteínas atadas. [10] La información estructural y la ubicación de la superficie de interacción pueden ser útiles para determinar el sitio de fusión al enlazador, aunque la información no es necesaria, ya que se pueden seleccionar múltiples combinaciones y permutaciones. [10] En segundo lugar, la creación de la proteína de fusión no debe alterar significativamente la localización, estabilidad o expresión de las proteínas a las que se unen los fragmentos en comparación con las proteínas endógenas de tipo salvaje . [10] Finalmente, la adición de la fusión del fragmento fluorescente no debe afectar la función biológica de la proteína, preferiblemente verificada mediante ensayos que evalúen todas las funciones conocidas de las proteínas. [10]
Diseño de enlazadores
Un enlazador es una secuencia corta de aminoácidos que une el fragmento de la proteína indicadora fluorescente a la proteína de interés, formando la proteína de fusión. Al diseñar una secuencia de enlazador, uno debe asegurarse de que el enlazador sea suficientemente soluble y largo para proporcionar a los fragmentos de proteína fluorescentes flexibilidad y libertad de movimiento de modo que el fragmento y su fragmento asociado colisionen con la frecuencia suficiente para reconstituirse durante la interacción de sus respectivos fusionados. proteínas. [1] Aunque no está documentado, es posible que la longitud o la secuencia del enlazador pueda influir en la complementación de algunas proteínas. [10] Las secuencias enlazadoras informadas RSIAT y RPACKIPNDLKQKVMNH (código de un solo aminoácido) y AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) se han utilizado con éxito en experimentos BiFC. [8] [12]
Creación de vectores de expresión de plásmidos adecuados
Al diseñar vectores plasmídicos para expresar las proteínas de interés, la construcción debe poder expresar proteínas que sean capaces de formar proteínas de fusión con fragmentos de proteínas fluorescentes sin alterar la función de la proteína. Además, el complejo de proteínas esperado debe poder aceptar la estabilización de la interacción del fragmento de proteína fluorescente sin afectar la función del complejo de proteínas o la célula que se está estudiando. En BiFC se pueden utilizar muchos fragmentos de proteínas fluorescentes que se combinan de varias formas. [8] [12] En general, se recomienda que YFP sirva como proteína informadora, escindida en el residuo 155 (N-terminal que consta de los residuos 1-154 y C-terminal que consta de los residuos 155-238) o el residuo 173 en particular, como estos conjuntos de fragmentos son altamente eficientes en su complementación cuando se fusionan con muchas proteínas que interactúan y producen niveles bajos de fluorescencia cuando se fusionan con proteínas que no interactúan. Se sugiere que cada proteína diana se fusiona con los fragmentos N- y C-terminales de la proteína indicadora fluorescente a su vez, y que los fragmentos se fusionan en cada uno de los extremos N- y C-terminales de las proteínas diana. Esto permitirá un total de ocho permutaciones diferentes, con interacciones probadas: [1]
Fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína
N-terminal 2 Fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína
N-terminal 2 Fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Selección del sistema de cultivo celular apropiado
Como se indicó anteriormente, es importante asegurarse de que la proteína indicadora fluorescente que se utiliza en BiFC sea apropiada y pueda expresarse en el sistema de cultivo celular de elección, ya que no todas las proteínas indicadoras pueden emitir fluorescencia o visualizarse en todos los sistemas modelo .
Selección de controles apropiados
Los fragmentos de proteínas fluorescentes pueden asociarse y emitir fluorescencia con baja eficiencia en ausencia de una interacción específica. Por lo tanto, es importante incluir controles para garantizar que la fluorescencia de la reconstitución de la proteína indicadora fluorescente no se deba a un contacto inespecífico. [13]
Algunos controles incluyen fragmentos de fluoróforo ligados a proteínas que no interactúan, ya que la presencia de estas fusiones tiende a disminuir la complementación inespecífica y los resultados falsos positivos . [7]
Otro control se crea uniendo el fragmento de proteína fluorescente a proteínas con caras de interacción mutadas. [8] [12] Siempre que el fragmento fluorescente se fusione con las proteínas mutadas de la misma manera que la proteína de tipo salvaje, y los niveles de expresión génica y la localización no se vean afectados por la mutación , esto sirve como un fuerte control negativo, ya que las proteínas mutantes y, por tanto, los fragmentos fluorescentes, no deberían poder interactuar.
Los controles internos también son necesarios para normalizar las diferencias en las eficiencias de transfección y la expresión génica en diferentes células. Esto se logra cotransfectando células con plásmidos que codifican las proteínas de fusión de interés, así como una proteína completa (no fragmentada) que presenta fluorescencia en una longitud de onda diferente de la proteína informadora fluorescente. Durante la visualización, se determinan las intensidades de fluorescencia del complejo BiFC y el control interno que, después de restar la señal de fondo, se convierte en una proporción. Esta relación representa la eficiencia de BiFC y se puede comparar con otras relaciones para determinar las eficiencias relativas de la formación de diferentes complejos. [10]
Transfección celular
Una vez que las proteínas de fusión y los controles se han diseñado y generado en su sistema de expresión apropiado, los plásmidos deben transfectarse en las células a estudiar. Después de la transfección, se debe esperar, típicamente unas ocho horas, para dar tiempo a que las proteínas de fusión interactúen y sus fragmentos de proteína informadora fluorescente enlazados se asocien y emitan fluorescencia. [8]
Visualización y análisis
Después de un tiempo suficiente para que las proteínas de fusión y sus fragmentos fluorescentes unidos interactúen y emitan fluorescencia, las células se pueden observar bajo un microscopio de fluorescencia invertido que puede visualizar la fluorescencia en las células. Aunque la intensidad de fluorescencia de los complejos BiFC suele ser <10% de la producida por la expresión de proteínas fluorescentes intactas, la autofluorescencia extremadamente baja en el rango visible en la mayoría de las células a menudo hace que la señal de BiFC sea de órdenes de magnitud mayor que la fluorescencia de fondo. [14]
Si se detecta fluorescencia cuando se expresan las proteínas de fusión, pero falta o se reduce significativamente después de la expresión del control negativo mutado, es probable que se produzca una interacción específica entre las dos proteínas diana de interés. Sin embargo, si la intensidad de la fluorescencia no es significativamente diferente entre la proteína de fusión de control negativo mutada y su contraparte de tipo salvaje, entonces es probable que la fluorescencia sea causada por interacciones de proteínas no específicas, por lo que se debe probar una combinación diferente de conformaciones de proteínas de fusión.
Si no se detecta fluorescencia, aún puede existir una interacción entre las proteínas de interés, ya que la creación de la proteína de fusión puede alterar la estructura o la cara de interacción de la proteína diana o los fragmentos de fluorescencia pueden ser físicamente incapaces de asociarse. Para garantizar que este resultado no sea un falso negativo , que no haya interacción, la interacción de la proteína debe probarse en una situación en la que la complementación y activación de la fluorescencia requiera una señal externa. En este caso, si la señal externa no provoca la asociación del fragmento de fluorescencia, es probable que las proteínas no interactúen o que exista un impedimento físico para la complementación de la fluorescencia. [10]
Fortalezas
Contexto biológico relevante
Las proteínas interactúan con diferentes proteínas asociadas y otras macromoléculas para lograr funciones que apoyan diferentes funciones en las células que apoyan la supervivencia del organismo. La identificación de estas interacciones puede proporcionar pistas sobre sus efectos en los procesos celulares. Como estas interacciones pueden verse afectadas tanto por el entorno interno como por los estímulos externos, el estudio de estas interacciones in vivo y a niveles endógenos, como se recomienda en BiFC, proporciona un contexto fisiológicamente relevante del que extraer conclusiones sobre las interacciones de proteínas.
Visualización directa
BiFC permite la visualización directa de interacciones de proteínas en células vivas con perturbación celular limitada , en lugar de depender de efectos secundarios o tinción por moléculas exógenas que pueden fallar en distribuirse uniformemente. [1] Esto, y la capacidad de observar las células vivas durante largos períodos de tiempo, es posible gracias a la fuerte fluorescencia intrínseca de la proteína informadora reconstituida que reduce las posibilidades de una lectura incorrecta asociada con el proceso de aislamiento de la proteína. [1] [15]
Sensibilidad
A diferencia de muchos ensayos de interacción de proteínas in vivo , BiFC no requiere que los complejos de proteínas estén formados por una gran proporción de proteínas o en proporciones estequiométricas . En cambio, BiFC puede detectar interacciones entre subpoblaciones de proteínas , interacciones débiles y proteínas de baja expresión debido a la complementación estable de la proteína informadora fluorescente. [11] [16] Además, se ha reportado una reconstitución exitosa de proteínas fluorescentes para proteínas asociadas a más de 7 nm de distancia, siempre que los enlazadores que unen el fragmento de fluoróforo a la proteína de interés tengan la flexibilidad necesaria para asociarse con su fragmento correspondiente. [13] Además, la fuerza de la interacción de la proteína se puede determinar cuantitativamente mediante cambios en la fuerza de la señal fluorescente. [2]
Resolucion espacial
BiFC permite la medición de cambios espaciales y temporales en complejos de proteínas, incluso en respuesta a fármacos activadores e inhibidores y subcelularmente, proporcionando la resolución espacial más alta de ensayos de interacción proteína-proteína in vivo . [8] [17] [18]
Sin equipo especializado
BiFC no requiere equipo especializado, ya que la visualización es posible con un microscopio de fluorescencia invertido que puede detectar la fluorescencia en las células. [13] Además, el análisis no requiere un procesamiento de datos complejo o la corrección de otras fuentes de fluorescencia. [8]
No se necesita información estructural
La BiFC se puede realizar sin información estructural sobre los socios de interacción, siempre que los fragmentos de la proteína indicadora fluorescente se puedan asociar dentro del complejo, ya que se pueden seleccionar múltiples combinaciones de proteínas de fusión. Esto se debe a la suposición de que, dado que las funciones de las proteínas se recapitulan en el contexto in vivo , la estructura compleja se parecerá a la de las proteínas intactas observadas fisiológicamente. [14]
Múltiples aplicaciones
La tecnología BiFC se ha refinado y ampliado para incluir la capacidad de visualizar simultáneamente múltiples complejos de proteínas en la misma célula , interacciones ARN / proteína , para detectar rápidamente cambios en las vías de transducción de genes, demostrar fenotipos ocultos de fármacos , donde el resultado del tratamiento previsto (p. Ej. muerte celular, diferenciación, cambio morfológico) in vivo , estudiar la formación de complejos en diferentes compartimentos celulares y mapear las superficies de interacción de proteínas [12] [18] [19] [20] [21]
Limitaciones
Detección en tiempo real
La señal fluorescente solo se produce después de que las proteínas hayan interactuado, lo que generalmente es del orden de horas. Por lo tanto, BiFC no puede proporcionar detección en tiempo real de interacciones de proteínas. El retraso de las reacciones químicas para generar fluoróforo también puede tener un efecto sobre la dinámica de la disociación compleja y el intercambio de parejas. [1] [7] [8] [22]
Formación de BiFC irreversible
La formación del complejo BiFC solo es reversible durante el paso inicial de reensamblaje de la proteína indicadora fluorescente, típicamente en el orden de milisegundos. Una vez que se ha reconstituido el fluorocromo, es esencialmente irreversible in vitro . Esto evita que las proteínas interactúen con otras y puede interrumpir la asociación / disociación de complejos de proteínas en equilibrio dinámico . [1]
Asociaciones independientes de fragmentos de proteínas fluorescentes
Los fragmentos de proteínas fluorescentes tienen una capacidad limitada para asociarse independientemente de las proteínas a las que están fusionados. Aunque la asociación independiente de proteínas variará dependiendo de las identidades de las proteínas de fusión y sus niveles de expresión, se deben proporcionar los controles necesarios y numerosos para distinguir entre interacciones proteicas positivas verdaderas y falsas. Generalmente, esta limitación se mitiga asegurando que las proteínas de fusión de interés se expresen en concentraciones endógenas. [1]
Alterar la estructura de las proteínas y el impedimento estérico.
El enlace del fragmento fluorescente puede alterar el plegamiento o la estructura de la proteína de interés, lo que lleva a la eliminación del sitio de unión superficial de una proteína que interactúa. Además, la disposición de los fragmentos fluorescentes puede prevenir la reconstitución de fluoróforos a través del impedimento estérico , aunque el impedimento estérico puede reducirse o eliminarse usando una secuencia enlazadora que permita suficiente flexibilidad para que los fragmentos fluorescentes se asocien. Por lo tanto, la ausencia de complementación de fluorescencia puede ser un falso negativo y no prueba necesariamente que no se produzca la interacción en cuestión.
Anaerobios obligados
Debido al requerimiento de oxígeno molecular para la formación de fluoróforos, BiFC no se puede utilizar en anaerobios obligados , que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. Esto limita el uso de BiFC a organismos aeróbicos . [1]
Autofluorescencia
La autofluorescencia no suele ser un problema, ya que la señal BiFC será mucho más alta que la del fondo. [23] [24] Sin embargo, ciertos organismos, especialmente la apicomplexa , tienen una mayor autofluorescencia que dificulta la aplicación de BiFC en ellos. [25] Ciertos hongos, como Candida albicans , también tienen un alto fondo autofluorescente, pero BiFC a menudo aún se puede realizar cuando se utilizan los controles y cepas adecuados. [26] [27]
Uso de proteínas de fusión
Debido a que las proteínas endógenas de tipo salvaje no pueden visualizarse in vivo , deben crearse proteínas de fusión y transfectarse sus plásmidos en las células estudiadas. Estas proteínas de fusión pueden no recapitular las funciones, la localización y las interacciones comunes a sus contrapartes de tipo salvaje, proporcionando una imagen inexacta de las proteínas en cuestión. Este problema se puede aliviar mediante el uso de información estructural y la ubicación de los sitios de interacción para identificar racionalmente los sitios de fusión en las proteínas de interés, utilizando controles apropiados y comparando los niveles de expresión y las funciones de la fusión y las proteínas de tipo salvaje a través de Western Blots y funcionales. Ensayos. [1]
Dependencia de la temperatura
Aunque las bajas temperaturas favorecen la reconstitución de la fluorescencia cuando los fragmentos están cerca, esto puede afectar el comportamiento de las proteínas diana y conducir a conclusiones inexactas con respecto a la naturaleza de las interacciones de las proteínas y sus socios interactuantes. [dieciséis]
Relación de interacción exacta desconocida
Debido a que la reconstitución del fluoróforo puede ocurrir a una distancia de 7 nm o más, la complementación de la fluorescencia puede indicar una interacción directa o indirecta (es decir, dentro del mismo complejo) entre las proteínas fusionadas de los fragmentos fluorescentes. [15]
Solicitud
Además de la validación de las interacciones proteína-proteína descritas anteriormente, BiFC se ha ampliado y adaptado a otras aplicaciones:
Ensamblaje de ribosomas bacterianos
El sistema BiFC se ha aplicado para registrar eventos de biogénesis de ribosomas en E. coli . [28] El proceso de ensamblaje de los ribosomas implica la nucleación de proteínas ribosómicas en el orden y la orientación adecuados. Las perturbaciones en el ensamblaje pueden provocar defectos estructurales en las subunidades ribosómicas que, como resultado, no pueden unirse en la orientación correcta para formar ribosomas completamente funcionales. Por lo tanto, los eventos de unión de subunidades señalados por la aparición de BiFC son una manera fácil de monitorear la biogénesis de ribosomas en contraste con los laboriosos métodos de elaboración de perfiles de polisomas.
Fluorescencia multicolor
Los fragmentos de proteínas fluorescentes utilizados en BiFC se han ampliado para incluir los colores azul, cian, verde, amarillo, rojo, cereza y Venus . [8] [12] [29] [30] Esta gama de colores ha hecho posible el desarrollo de análisis de complementación de fluorescencia multicolor. [12] Esta técnica permite visualizar múltiples complejos de proteínas simultáneamente en la misma célula. Además, las proteínas suelen tener una gran cantidad de compañeros de interacción alternativos. Por lo tanto, al fusionar fragmentos de diferentes proteínas fluorescentes con proteínas candidatas, se puede estudiar la competencia entre compañeros de interacción alternativos para la formación de complejos mediante la complementación de diferentes fragmentos de colores fluorescentes. [12]
Interacciones de proteínas de unión a ARN
BiFC se ha ampliado para incluir el estudio de las interacciones de proteínas de unión a ARN en un método que Rackham y Brown describieron como complementación de fluorescencia trimolecular (TriFC). [19] En este método, un fragmento de la proteína fluorescente de Venus se fusiona con el ARNm de interés y la porción complementaria de Venus se fusiona con la proteína de unión al ARN de interés. De manera similar a BiFC, si el ARNm y la proteína interactúan, la proteína de Venus se reconstituirá y emitirá fluorescencia. También conocido como el método del puente de ARN, ya que el fluoróforo y otras proteínas que interactúan forman un puente entre la proteína y el ARN de interés, esto permite una detección y localización simple de interacciones ARN-proteína dentro de una célula viva y proporciona un método simple para detectar asociación directa o indirecta de ARN-proteína (es decir, dentro de un complejo) que puede verificarse mediante análisis in vitro de compuestos purificados o eliminación de ARNi de la (s) molécula (s) puente. [19]
Cascadas de organización de vías y transducción de señales
BiFC se puede utilizar para vincular genes entre sí y su función mediante la medición de interacciones entre las proteínas que codifican los genes. [20] [21] Esta aplicación es ideal para genes novedosos de los que se sabe poco acerca de sus efectores ascendentes y descendentes , ya que se pueden establecer nuevos enlaces de vías. Además, los efectos de los fármacos, las hormonas o la eliminación o desactivación del gen de interés, y los efectos posteriores tanto en la fuerza de las interacciones proteína-proteína como en la ubicación de la interacción, pueden observarse en segundos. [17] [18]
Formación de complejos en diferentes compartimentos celulares.
BiFC se ha utilizado para estudiar la translocación nuclear , a través de una localización compleja, así como las interacciones que involucran proteínas integrales de la membrana . [8] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] Por lo tanto, BiFC es una herramienta importante para comprender la localización del factor de transcripción en los compartimentos subcelulares.
Cuantificación de superficies de interacción proteína-proteína
BiFC se ha acoplado con citometría de flujo (BiFC-FC). Esto permite cartografiar las superficies de interacción proteína-proteína mediante la introducción de mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio que afectan la formación de complejos. [2]
Comparaciones con otras tecnologías
La mayoría de las técnicas utilizadas para estudiar las interacciones proteína-proteína se basan en métodos in vitro . Desafortunadamente, el estudio de las proteínas en un sistema artificial, fuera de su entorno celular, plantea una serie de dificultades. Por ejemplo, esto puede requerir la eliminación de proteínas de su entorno celular normal. El procesamiento requerido para aislar la proteína puede afectar sus interacciones con otras proteínas. Además, el aislamiento de la proteína de la señalización intracelular y los mecanismos que ocurren en la célula normal puede proporcionar una imagen engañosa de las ocurrencias intracelulares y fisiológicas. [1] Además, las proteínas estudiadas in vitro pueden estudiarse en concentraciones muy diferentes de sus niveles normales de abundancia, pueden no necesariamente ser transportadas de manera eficiente a las células o pueden no ser lo suficientemente selectivas para funcionar en el genoma del huésped. [38] [39] [40] [41] Finalmente, mediante el estudio de proteínas in vitro , no se puede determinar la influencia de interacciones proteína-proteína específicas en la célula sobre las consecuencias funcionales o fisiológicas.
Otros ensayos in vivo que se utilizan con más frecuencia para estudiar las interacciones proteína-proteína incluyen la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ) y el ensayo de dos híbridos de levadura ( Y2H ). Cada uno de estos ensayos tiene sus ventajas y desventajas en comparación con BiFC:
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)
La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ( FRET ), también conocida como transferencia de energía de resonancia anterior , transferencia de energía de resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ), se basa en la transferencia de energía de un cromóforo o fluoróforo excitado ( donante ) (si los cromóforos son fluorescentes) a un aceptor cercano . En este método, los fluoróforos se unen químicamente o se fusionan genéticamente a dos proteínas que se supone que interactúan. Si las proteínas interactúan, esto traerá a los fluoróforos a una estrecha proximidad espacial. Si los fluoróforos están orientados de una manera que exponen los fluoróforos entre sí, lo que generalmente se asegura al diseñar y construir el enlace / fusión fluoróforo-proteína, entonces la transferencia de energía del fluoróforo donante excitado dará como resultado un cambio en las intensidades fluorescentes o en la vida útil. de los fluoróforos. [1] [13]
Levadura de dos híbridos (Y2H)
La levadura de dos híbridos ( Y2H ) es una técnica de cribado genético que se puede utilizar para detectar interacciones físicas (de unión) proteína-proteína o proteína-ADN . Por lo general, se aplica en el organismo modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae . Prueba una proteína 'cebo' de función (desconocida) que se fusiona, por ejemplo, con el dominio de unión del factor de transcripción GAL4 contra posibles proteínas interactuantes o una biblioteca de ADNc que expresan, por ejemplo, el dominio de activación GAL4 (el ' presa'). [42] [43]
Comparaciones tecnológicas
Tecnología de comparación | Similitud con BiFC | Ventajas | Desventajas | |
---|---|---|---|---|
PREOCUPARSE | Capacidad para detectar y localizar sitios de interacción de proteínas dentro de células vivas [13] | Monitoreo instantáneo en tiempo real de las interacciones de proteínas
Interacción fluoróforo reversible
| Proximidad espacial cercana [44]
Disminución de la sensibilidad [44]
Foto-blanqueamiento irreversible [45] [46] [47]
| |
Y2H | Técnica in vivo utilizada para detectar interacciones | Pantalla de interacción genética
| Vínculo tentativo cebo-presa [13]
Activación de transcripción errónea [13]
Complementación genética [4] [5]
Levadura como organismo modelo [48] [49]
Sobreexpresión de proteínas [15]
Localización nuclear [15]
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Referencias
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enlaces externos
- Laboratorio de Kerppola en línea - BiFC
- Presentación del Dr. CD Hu - Complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC): Principios y aplicaciones