Los bioinformadores son células microbianas vivas e intactas que han sido diseñadas genéticamente para producir una señal medible en respuesta a un agente químico o físico específico en su entorno . Los bioinformadores contienen dos elementos genéticos esenciales, un gen promotor y un gen informador . El gen promotor está encendido ( transcrito) cuando el agente objetivo está presente en el entorno de la célula. El gen promotor en una célula bacteriana normal está ligado a otros genes que luego también se transcriben y luego se traducen en proteínas que ayudan a la célula a combatir o adaptarse al agente al que ha estado expuesta. En el caso de un bioinformador, estos genes, o partes de los mismos, se han eliminado y reemplazado por un gen informador. En consecuencia, activar el gen promotor ahora hace que se active el gen informador. La activación del gen informador conduce a la producción de proteínas informadoras que, en última instancia, generan algún tipo de señal detectable. Por lo tanto, la presencia de una señal indica que el bioinformador ha detectado un agente diana particular en su entorno.
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Desarrollados originalmente para el análisis fundamental de los factores que afectan la expresión génica , los bioinformadores se aplicaron desde el principio para la detección de contaminantes ambientales [1] y desde entonces han evolucionado en campos tan diversos como el diagnóstico médico , la agricultura de precisión , la garantía de la seguridad alimentaria , el seguimiento y control de procesos, y Computación bio- microelectrónica . Su versatilidad se debe al hecho de que existe una gran cantidad de sistemas de genes indicadores que son capaces de generar una variedad de señales. Además, los genes indicadores pueden insertarse genéticamente en células bacterianas , de levadura , vegetales y de mamíferos , proporcionando así una funcionalidad considerable en una amplia gama de vectores hospedadores.
Sistemas de genes informadores
Hay varios tipos de genes informadores disponibles para su uso en la construcción de organismos bioinformadores, y las señales que generan normalmente se pueden clasificar como colorimétricas , fluorescentes , luminiscentes , quimioluminiscentes o electroquímicas . Aunque cada uno funciona de manera diferente, su producto final siempre permanece igual: una señal medible que es proporcional a la concentración del agente químico o físico único al que han estado expuestos. En algunos casos, la señal solo ocurre cuando se agrega un sustrato secundario al bioensayo ( luxAB , Luc y aequorin). Para otros bioreportadores, la señal debe ser activada por una fuente de luz externa (GFP y UMT), y para unos pocos bioreportadores seleccionados, la señal es completamente autoinducida, sin necesidad de sustrato exógeno o activación externa ( luxCDABE ). Las siguientes secciones describen brevemente algunos de los sistemas de genes informadores disponibles y sus aplicaciones existentes.
Luciferasa bacteriana (Lux)
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La luciferasa es un nombre genérico para una enzima que cataliza una reacción de emisión de luz. Las luciferasas se pueden encontrar en bacterias, algas, hongos, medusas, insectos, camarones y calamares, y la luz resultante que producen estos organismos se denomina bioluminiscencia. En las bacterias, los genes responsables de la reacción de emisión de luz (los genes lux ) se han aislado y se han utilizado ampliamente en la construcción de bioinformadores que emiten una luz azul verdosa con una intensidad máxima a 490 nm. [2] Hay tres variantes de lux disponibles, una que funciona a <30 ° C, otra a <37 ° C y una tercera a <45 ° C. El sistema genético lux consta de cinco genes, luxA , luxB , luxC , luxD y luxE . Dependiendo de la combinación de estos genes utilizada, se pueden construir varios tipos diferentes de bioinformadores bioluminiscentes .
Bioreportadores luxAB
Los bioinformadores luxAB contienen solo los genes luxA y luxB , que juntos son responsables de generar la señal luminosa. Sin embargo, para completar completamente la reacción de emisión de luz, se debe suministrar un sustrato a la celda. Por lo general, esto ocurre mediante la adición del decanal químico en algún momento durante el procedimiento de bioensayo. Se han construido numerosos bioinformadores de luxAB en sistemas celulares de bacterias, levaduras, insectos, nematodos, plantas y mamíferos.
luxCDABE Bioreportadores
En lugar de contener solo los genes luxA y luxB , los bioinformadores pueden contener los cinco genes del casete lux , lo que permite un sistema de generación de luz completamente independiente que no requiere adiciones extrañas de sustrato ni excitación por una fuente de luz externa. Entonces, en este bioensayo, el bioinformador simplemente se expone a un analito objetivo y un aumento cuantitativo en los resultados de bioluminiscencia, a menudo en menos de una hora. Debido a su rapidez y facilidad de uso, junto con la capacidad de realizar el bioensayo repetidamente en tiempo real y en línea, hace que los bioinformes de luxCDABE sean extremadamente atractivos. En consecuencia, se han incorporado a una amplia gama de metodologías de detección que van desde la detección de contaminantes ambientales hasta el monitoreo en tiempo real de infecciones por patógenos en ratones vivos.
Inespecíficos lux Bioreporters
Los bioinformadores de lux inespecíficos se utilizan normalmente para la detección de toxinas químicas. Por lo general, están diseñados para bioluminiscencia continua. Tras la exposición a una toxina química, la célula muere o se retarda su actividad metabólica, lo que lleva a una disminución de los niveles de luz bioluminiscente . Su aplicación más familiar es en el ensayo Microtox [1] donde, tras una breve exposición a varias concentraciones de la muestra, la bioluminiscencia disminuida puede correlacionarse con niveles relativos de toxicidad . [3]
Luciferasa de luciérnaga (Luc)
La luciferasa de luciérnaga cataliza una reacción que produce luz visible en el rango de 550 a 575 nm. También está disponible una luciferasa de escarabajo clic que produce luz en un pico más cercano a 595 nm. Ambas luciferasas requieren la adición de un sustrato exógeno (luciferina) para que ocurra la reacción a la luz. Se han elaborado numerosos bioinformes basados en luc para la detección de una amplia gama de compuestos inorgánicos y orgánicos de interés medioambiental. Sin embargo, las aplicaciones más prometedoras probablemente se basan en la introducción del código genético de la luciferasa de luciérnaga en otras células y tejidos eucariotas.
Diagnósticos médicos
La inserción de los genes luc en una línea celular de carcinoma de cuello uterino humano ( HeLa ) ilustró que el aclaramiento de las células tumorales se puede visualizar dentro de un ratón vivo simplemente escaneando con una cámara de dispositivo de carga acoplada , lo que permite monitorear rápidamente el tratamiento de quimioterapia en línea. y en tiempo real. [4] En otro ejemplo, los genes luc se insertaron en líneas celulares de cáncer de mama humano para desarrollar un bioensayo para la detección y medición de sustancias con potencial actividad estrogénica y antiestrogénica. [5]
Investigación sobre regulación genética
Se pueden colocar promotores particulares cadena arriba del gen luc , es decir, la secuencia luc se puede fusionar con la secuencia promotora a nivel de ADN. Si dicha construcción no tiene un tamaño demasiado grande, simplemente puede introducirse en células eucariotas utilizando plásmidos . Este enfoque se usa ampliamente para estudiar la actividad de un promotor dado en un tipo de tejido / célula dado, ya que la cantidad de luz producida por la luciferasa es directamente proporcional a la actividad del promotor. [6] Además de estudiar los promotores, los ensayos de luciferasa de luciérnaga ofrecen la opción de estudiar los activadores transcripcionales : en estos experimentos se utiliza típicamente el sistema GAL4 / UAS y su secuencia de ADN activadora (UAS) de Gal4 se coloca corriente arriba del gen luc mientras que los diferentes los activadores o las diferentes variantes / fragmentos del mismo activador se fusionan con el módulo de unión al ADN de GAL4 a nivel de proteína. De esta manera, la actividad transcripcional de las diferentes proteínas de fusión GAL4 se puede comparar directamente usando luz como lectura. [7]
Aequorin
Aequorin es una fotoproteína aislada de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria . Tras la adición de iones de calcio (Ca2 +) y coelenterazina, se produce una reacción cuyo resultado final es la generación de luz azul en el rango de 460 - 470 nm. Se ha incorporado aequorina en líneas de células B humanas para la detección de bacterias y virus patógenos en lo que se conoce como el ensayo Cell CANARY (análisis celular y notificación de riesgos y rendimientos de antígenos). [8] Las células B están diseñadas genéticamente para producir aequorina. Tras la exposición a antígenos de diferentes patógenos, las células B recombinantes emiten luz como resultado de la activación de una cascada de señalización intracelular que libera iones calcio dentro de la célula.
Proteína verde fluorescente (GFP)
La proteína verde fluorescente (GFP) es también una fotoproteína aislada y clonada de la medusa Aequorea victoria . [9] También se han aislado variantes del pensamiento marino Renilla reniformis . La GFP, como la aequorina, produce una señal fluorescente azul, pero sin la adición necesaria de un sustrato exógeno. Todo lo que se requiere es una fuente de luz ultravioleta para activar las propiedades fluorescentes de la fotoproteína. Esta capacidad de autofluorescencia hace que la GFP sea muy deseable en los ensayos de biodetección, ya que se puede utilizar en línea y para monitorizar células vivas intactas. Además, la capacidad de alterar la GFP para producir emisiones de luz además del azul (es decir, cian, rojo y amarillo) permite que se utilice como detector multianalito. En consecuencia, la GFP se ha utilizado ampliamente en construcciones de bioinformador en hospedadores bacterianos, de levadura, nematodos, vegetales y mamíferos.
Uroporfirinógeno (urogen) III metiltransferasa (UMT)
Uroporfirinógeno (urogen) III metiltransferasa (UMT) cataliza una reacción que produce dos productos fluorescentes que producen una fluorescencia rojo-naranja en el rango de 590 - 770 nm cuando se ilumina con luz ultravioleta . [10] Al igual que con GFP, no se requiere la adición de sustratos exógenos. UMT se ha utilizado como bioinformador para la selección de plásmidos recombinantes , como marcador para la transcripción de genes en células bacterianas, de levadura y de mamíferos, y para la detección de sales tóxicas como arsenito y antimonita .
Notas
- ^ King, JMH y col. (1990) Tecnología informadora de bioluminiscencia sensible y rápida para la exposición y biodegradación de naftaleno. Science 249, 778-781. http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/249/4970/778?ck=nck
- ^ Meighen, EA (1994) Genética de la bioluminiscencia bacteriana. Annu. Rev. Genet. 28, 117-139. http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.ge.28.120194.001001
- ^ Hermens, J. et al. (1985) Relaciones cuantitativas estructura-actividad y toxicidad de la mezcla de sustancias químicas orgánicas en Photobacterium phosphoreum: la prueba Microtox. Ecotoxicol. Reinar. Saf. 9, 17-25. https://doi.org/10.1007%2Fs11434-006-2168-z
- ^ Contag, CH y col. (2000) Uso de genes indicadores para mediciones ópticas de enfermedades neoplásicas in vivo. Neoplasia 2 (1-2), 41-52. http://neoreviews.aappublications.org/cgi/content/extract/1/12/e225
- ^ Legler, J. et al. (1999) Desarrollo de un ensayo de gen indicador de luciferasa mediado por receptor de estrógeno transfectado de forma estable en la línea celular de cáncer de mama T47D humano. Toxicol. Sci. 48 (1), 55-66. http://toxsci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/48/1/55
- ^ Kovács KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (septiembre de 2006). "C / EBPbeta acopla la señalización de dopamina a la expresión del gen precursor de la sustancia P en neuronas estriatales". Revista de neuroquímica . 98 (5): 1390–9. doi : 10.1111 / j.1471-4159.2006.03957.x . PMID 16771829 .
- ^ Kovács KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (noviembre de 2015). "Regulación compleja de la proteína de unión a CREB por la proteína quinasa 2 que interactúa con el homeodominio" (PDF) . Señalización celular . 27 (11): 2252–60. doi : 10.1016 / j.cellsig.2015.08.001 . PMID 26247811 .
- ^ Rider, T. et al. (1999) En el Simposio de imágenes biomédicas de NASA / NCI.
- ^ Misteli, T. y Spector, DL (1997) Aplicación de la proteína verde fluorescente en biología celular y biotecnología. Nat. Biotechnol. 15, 961-964.
- ^ Sattler, I. et al. (1995) Clonación, secuenciación y expresión del gen cobA de metiltransferasa de uroporfirinógeno-III de Propionibacterium freudenreichii (shermanii). J. Bacteriol. 177, 1564-1569. http://jb.asm.org/cgi/content/abstract/177/6/1564