CAPP-Seq
El perfil personalizado de cáncer mediante secuenciación profunda ( CAPP - Seq ) es un método basado en la secuenciación de última generación que se utiliza para cuantificar el ADN circulante en el cáncer ( ADNct ) . El método fue presentado en 2014 por los laboratorios de Ash Alizadeh y Maximilian Diehn en Stanford, como una herramienta para medir el ADN tumoral libre de células que se libera de las células tumorales muertas en la sangre y, por lo tanto, puede reflejar el genoma tumoral completo. Este método se puede generalizar para cualquier tipo de cáncer que se sepa que tiene mutaciones recurrentes. [1] CAPP-Seq puede detectar una molécula de ADN mutante en 10 000 moléculas de ADN sano. El método original [1]se perfeccionó aún más en 2016 para la detección ultrasensible a través de la integración de múltiples estrategias de supresión de errores, denominada supresión digital de errores integrada (iDES). [2] El uso de ctDNA en esta técnica no debe confundirse con las células tumorales circulantes (CTC); estas son dos entidades diferentes. [3]
Descrito originalmente como un método para detectar y controlar los cánceres de pulmón, [1] [2] CAPP-Seq ha sido adaptado con éxito para una amplia variedad de cánceres por varios grupos independientes. Estos incluyen linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), [4] linfoma folicular (FL), [4] trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante (PTLD), [5] cáncer colorrectal metastásico de ovario, [6] cáncer de esófago , [7] ] cáncer de páncreas , [8] cáncer de vejiga , [9] leiomiosarcoma , [10] diversos adultos y niñossarcomas , [11] entre otros.
El análisis de población se realiza para identificar mutaciones recurrentes en un tipo de cáncer dado. Esto se hace mediante el análisis de conjuntos de datos públicos como la base de datos de cáncer COSMIC y TCGA . Se diseña un 'selector' que consta de sondas de oligonucleótidos de ADN biotinilado que se dirigen a las regiones mutadas recurrentemente elegidas para el tipo de cáncer específico. El selector se elige utilizando un enfoque de bioinformática multifase. Con el selector, se realiza una captura de hibridación basada en sondas en el ADN tumoral y normal para descubrir mutaciones específicas del paciente. Luego, la captura de hibridación también se aplica a ctDNA para cuantificar las mutaciones que se descubrieron previamente. [1]
Se extrae sangre periférica de los pacientes y se aísla ctDNA de ≥1 ml de plasma . El ADN de entrada puede ser tan bajo como 4 ng. [1]
Estos se lograron permitiendo que la ligadura del adaptador se llevara a cabo a 16 ℃ durante 16 horas para aumentar la eficiencia y la recuperación de la ligadura del adaptador. La adaptación más importante es durante los pasos enzimáticos y de limpieza; se realizan con cordón, con el fin de minimizar los pasos de transferencia del tubo, lo que aumenta la recuperación.
En CAPP-Seq, el diseño del selector es un paso crucial que identifica mutaciones recurrentes en un tipo de cáncer en particular utilizando datos de secuenciación de próxima generación disponibles públicamente. Para su inclusión en el selector CAPP-seq, las mutaciones recurrentes que se enriquecen en una población se describen mediante un índice Índice de recurrencia (IR). RI es el número de mutaciones por kilobase de un locus genómico dado de un paciente portador de mutaciones particulares. RI representa una frecuencia de recurrencia a nivel de paciente estimada para mutaciones somáticas y todas las mutaciones. Las mutaciones recurrentes conocidas e impulsoras en una población se pueden clasificar según el RI y, por lo tanto, el RI se utiliza para diseñar un selector. Se emplea una estrategia de diseño de seis fases para seleccionar el diseño. [1]
