CLARIDAD
CLARITY [1] es un método para hacer que los tejidos sean transparentes utilizando hidrogeles a base de acrilamida construidos desde dentro y unidos al tejido, y como se define en el documento inicial, representa la "transformación de tejido biológico intacto en una forma híbrida en la que componentes específicos se sustituyen por elementos exógenos que aportan nueva accesibilidad o funcionalidad ”. [1] Cuando se acompaña de un etiquetado basado en anticuerpos o genes, CLARITY permite obtener imágenes muy detalladas de la estructura de proteínas y ácidos nucleicos de los órganos, especialmente el cerebro . Fue desarrollado por Kwanghun Chung y Karl Deisseroth en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford . [2]
Varios artículos publicados han aplicado el método CLARITY a una amplia gama de tejidos y estados patológicos como la inmuno-oncología para el cáncer de mama humano, [3] cerebros humanos con enfermedad de Alzheimer , [4] médula espinal de ratón, [5] modelos animales de esclerosis múltiple , [6] y plantas. [7] CLARITY también se ha combinado con otras tecnologías para desarrollar nuevos métodos de microscopía, incluida la microscopía de expansión confocal , la microscopía de lámina de luz SPIM y la microscopía de lámina de luz optimizada para CLARITY (COLM). [8]
El proceso de aplicación de imágenes CLARITY comienza con una muestra de tejido post mortem . Dependiendo del tipo de tejido, pueden ser necesarios pasos de preprocesamiento, como la desmineralización o la decoloración, después de la fijación de la muestra. A continuación se debe aplicar una serie de tratamientos químicos para lograr la transparencia, en los que se elimina el contenido lipídico de la muestra, mientras se deja en su lugar casi la totalidad de las proteínas y ácidos nucleicos originales . [1]El propósito de esto es hacer que el tejido sea transparente y, por lo tanto, susceptible de una investigación microscópica detallada de sus partes funcionales constituyentes (que son predominantemente proteínas y ácidos nucleicos). Para lograr esto, la estructura proteica preexistente debe colocarse en un armazón transparente que la preserve, mientras se eliminan los componentes lipídicos. Este "andamiaje" está formado por monómeros de hidrogel como la acrilamida. La adición de moléculas como formaldehído , paraformaldehído o glutaraldehído puede facilitar la unión del andamiaje a las proteínas y ácidos nucleicos que se van a conservar, y la adición de calor es necesaria para establecer los vínculos reales entre los componentes celulares y la acrilamida. [9]
Una vez que se completa este paso, los componentes de proteína y ácido nucleico de las células del tejido diana se mantienen firmemente en su lugar, mientras que los componentes lipídicos permanecen separados. Luego, los lípidos se eliminan durante días o semanas para su difusión pasiva en detergente, o se aceleran mediante métodos electroforéticos a solo horas o días. [10] [11] Los esfuerzos para acelerar mediante métodos electroforéticos siguen sin ser concluyentes sobre la capacidad de no causar daño tisular. A medida que pasan, las propiedades lipofílicas del detergente le permiten recoger y eliminar los lípidos que se encuentren en el camino. Los tintes lipofílicos como DiI se eliminan, sin embargo, hay tintes lipofílicos compatibles con CLARITY que se pueden fijar a proteínas vecinas. [12]La gran mayoría de moléculas no lipídicas, como las proteínas y el ADN, no se ven afectadas por este procedimiento, gracias al gel de acrilamida y a las propiedades químicas de las moléculas implicadas. [9]
Como se informó en el artículo inicial, el tejido se expande durante este proceso, pero, según sea necesario, se puede restaurar a sus dimensiones iniciales con un paso final de incubación en una solución de coincidencia de índice de refracción. [1] La expansión tisular ocurre en el cerebro excepcionalmente rico en lípidos; sin embargo, se ha observado que otros tipos de tejidos no experimentan tanta expansión tisular durante todo el proceso.
