COLD-PCR ( co -amplification en l ower d temperatura enaturation PCR ) es un modificado reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de protocolo que enriquece variante alelos de una mezcla de tipo salvaje y mutación que contiene ADN . La capacidad de amplificar e identificar preferentemente alelos minoritarios y mutaciones de ADN somático de bajo nivel en presencia de un exceso de alelos de tipo salvaje es útil para la detección de mutaciones. La detección de mutaciones es importante en el caso de la detección temprana del cáncer a partir de biopsias de tejidos y fluidos corporales comoplasma sanguíneo o suero , evaluación de la enfermedad residual después de la cirugía o quimioterapia , estadificación de la enfermedad y perfil molecular para el pronóstico o adaptación de la terapia a pacientes individuales, y monitoreo del resultado de la terapia y remisión o recaída del cáncer. La PCR común amplificará tanto el alelo principal (tipo salvaje) como el alelo menor (mutante) con la misma eficacia, ocluyendo la capacidad de detectar fácilmente la presencia de mutaciones de bajo nivel. La capacidad de detectar una mutación en una mezcla de ADN variante / salvaje es valiosa porque esta mezcla de ADN variante puede ocurrir cuando se le proporciona una muestra heterogénea, como suele ser el caso de las biopsias de cáncer. Actualmente, la PCR tradicional se utiliza junto con varios ensayos posteriores diferentes para la determinación del genotipo o la detección de mutaciones somáticas . Estos pueden incluir el uso de ADN amplificado para análisis RFLP , genotipado MALDI-TOF (desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo) o secuenciación directa para la detección de mutaciones mediante secuenciación de Sanger o pirosecuenciación . Reemplazar la PCR tradicional con COLD-PCR para estos ensayos posteriores aumentará la confiabilidad en la detección de mutaciones de muestras mixtas, incluidos tumores y fluidos corporales.
Descripción general del método COLD-PCR
El principio subyacente de COLD-PCR es que los desajustes de un solo nucleótido alterarán ligeramente la temperatura de fusión (Tm) del ADN de doble hebra. Dependiendo del contexto de la secuencia y la posición del desajuste, los cambios de Tm de 0,2–1,5 ° C (0,36–2,7 ° F) son comunes para secuencias de hasta 200 pb o más. Sabiendo esto, los autores del protocolo aprovecharon dos observaciones:
- Cada ADN de doble hebra tiene una 'temperatura crítica' (Tc) más baja que su Tm. La eficacia de la amplificación por PCR desciende considerablemente por debajo de la Tc.
- La Tc depende de la secuencia de ADN. Dos fragmentos de ADN molde que difieren en sólo uno o dos desajustes de nucleótidos tendrán diferentes eficiencias de amplificación si el paso de desnaturalización de la PCR se establece en Tc.
Teniendo en cuenta estos principios, los autores desarrollaron el siguiente protocolo general:
- Etapa de desnaturalización. El ADN se desnaturaliza a alta temperatura, generalmente 94 ° C (201 ° F).
- Etapa de recocido intermedio. Establezca una temperatura de hibridación intermedia que permita la hibridación del ADN del alelo mutante y de tipo salvaje entre sí. Debido a que el ADN del alelo mutante forma la minoría del ADN en la mezcla, será más probable que formen ADN heterodúplex que no coincida con el ADN de tipo salvaje.
- Fase de fusión. Estos heterodúplex se derretirán más fácilmente a temperaturas más bajas. Por tanto, se desnaturalizan selectivamente en el Tc.
- Etapa de recocido de imprimación. El ADN homo-dúplex preferentemente permanecerá bicatenario y no estará disponible para el apareamiento de cebadores.
- Etapa de extensión. La ADN polimerasa se extenderá de forma complementaria al ADN molde. Dado que el ADN heterodúplex se usa como molde, se amplificará una proporción mayor de ADN de variante menor y estará disponible para rondas posteriores de PCR.
Hay dos formas de COLD-PCR que se han desarrollado hasta la fecha. PCR en frío completo y PCR en frío rápido.
PCR en FRÍO completo
El COLD-PCR completo es idéntico al protocolo descrito anteriormente. Estas cinco etapas se utilizan para cada ronda de amplificación.
PCR en frío rápido
Fast COLD-PCR difiere de Full COLD-PCR en que se omiten las etapas de desnaturalización y recocido intermedio. Esto se debe a que, en algunos casos, la amplificación preferencial del ADN mutante es tan grande que no es necesario garantizar la formación del ADN heterodúplex mutante / de tipo salvaje. Por tanto, la desnaturalización puede producirse en la Tc, proceder a la hibridación del cebador y luego a la extensión mediada por la polimerasa. Cada ronda de amplificación incluirá estas tres etapas en ese orden. Al utilizar la temperatura de desnaturalización más baja, la reacción discriminará hacia los productos con la Tm más baja, es decir, los alelos variantes. La PCR en frío rápida produce resultados mucho más rápidos debido al protocolo abreviado. Sin embargo, es importante tener en cuenta que Full COLD-PCR es esencial para la amplificación de todas las posibles mutaciones en la mezcla inicial de ADN.
COLD-PCR de dos rondas es una versión modificada de Fast COLD-PCR. Durante la segunda ronda de Fast COLD-PCR se utilizan cebadores anidados. Esto mejora la sensibilidad de la detección de mutaciones en comparación con Fast COLD-PCR de una ronda. [1]
Uso de COLD-PCR hasta la fecha
COLD-PCR se ha utilizado para mejorar la fiabilidad de varios ensayos diferentes que tradicionalmente utilizan PCR convencional.
RFLP y COLD-PCR
Un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción da como resultado la escisión (o ausencia del mismo) del ADN para una mutación específica por una enzima de restricción seleccionada que no escindirá el ADN de tipo salvaje. En un estudio que utilizó una mezcla de tipo salvaje y mutación que contiene ADN amplificado por PCR regular o COLD-PCR, se demostró que el análisis de RFLP anterior a COLD-PCR mejora la detección de la mutación entre 10 y 20 veces. [2]
Secuenciación de Sanger y COLD-PCR
La secuenciación de Sanger se utilizó recientemente para evaluar el enriquecimiento de ADN mutante de una mezcla de 1:20 mutante: ADN de tipo salvaje. La variante de ADN que contiene una mutación se obtuvo de una línea celular de cáncer de mama que se sabe que contiene mutaciones de p53 . [1] La comparación de los cromatogramas de secuenciación de Sanger indicó que el alelo mutante se enriqueció 13 veces cuando se utilizó COLD-PCR en comparación con la PCR tradicional sola. [1] Esto se determinó por el tamaño de los picos en el cromatograma en la ubicación del alelo variante.
Además, se utilizó COLD-PCR para detectar mutaciones de p53 en muestras de adenocarcinoma de pulmón . El estudio pudo detectar 8 mutaciones de bajo nivel (menos del 20% de abundancia) que probablemente se hubieran pasado por alto usando métodos convencionales que no enriquecen el ADN de secuencia variante.
Pirosecuenciación y COLD-PCR
Similar a su uso en secuenciación directa de Sanger, con pirosecuenciación COLD-PCR demostró ser capaz de detectar mutaciones que tenían una prevalencia de 0.5-1% de las muestras utilizadas. [3] Se utilizó COLD-PCR para detectar mutaciones de p53 y KRAS mediante pirosecuenciación, y se demostró que supera a la PCR convencional en ambos casos.
MALDI-TOF y COLD-PCR
El mismo grupo de investigación que desarrolló COLD-PCR y lo usó para comparar la sensibilidad de la PCR regular para la genotipificación con la secuenciación directa de Sanger, RFLP y pirosecuenciación, también realizó un estudio similar utilizando MALDI-TOF como una aplicación posterior para detectar mutaciones. Sus resultados indicaron que COLD-PCR podría enriquecer las secuencias de mutación de una mezcla de ADN de 10 a 100 veces y que las mutaciones con una prevalencia inicial de 0,1 a 0,5% serían detectables. [4] En comparación con la tasa de detección de bajo nivel de 5 a 10% esperada con la PCR tradicional.
QPCR y COLD-PCR
Se demostró que la ejecución de COLD-PCR en una máquina de PCR cuantitativa , utilizando sondas TaqMan específicas para una mutación, aumentaba la diferencia medida entre las muestras mutantes y de tipo salvaje. [4]
Ventajas de COLD-PCR
- Método de un solo paso capaz de enriquecer alelos minoritarios conocidos y desconocidos independientemente del tipo de mutación y la posición.
- No requiere reactivos adicionales ni maquinaria especializada. Por lo tanto, el costo no aumenta.
- Mejor que la PCR convencional para la detección de mutaciones en una muestra mixta.
- No aumenta significativamente el tiempo de ejecución del experimento en comparación con la PCR convencional.
Desventajas de COLD-PCR
- Se debe medir y determinar la Tc óptima para cada amplicón. Añadiendo un paso adicional a los procedimientos convencionales basados en PCR.
- Requisito para un control preciso de la temperatura de desnaturalización durante la PCR dentro de ± 0,3 ° C (0,54 ° F).
- Puede que no esté disponible una temperatura crítica adecuada que diferencie entre secuencias de ADN mutantes y de tipo salvaje.
- Restringido al análisis de secuencias de menos de 200 pb aproximadamente.
- Vulnerable a los errores introducidos por la polimerasa.
- Enriquecimiento de mutación global variable que depende de la posición del ADN y la sustitución de nucleótidos.
- No hay garantía de que todas las mutaciones de bajo nivel se enriquezcan preferentemente.
Historia
COLD-PCR fue descrita originalmente por Li et al. en un artículo de Nature Medicine publicado en 2008 por el grupo de laboratorio de Mike Makrigiorgos en el Instituto de Cáncer Dana Farber de la Facultad de Medicina de Harvard. [2] Como se ha resumido anteriormente, la tecnología se ha utilizado en una serie de experimentos de prueba de principio y experimentos de diagnóstico de investigación médica.
Recientemente, la tecnología COLD-PCR ha sido licenciada por Transgenomic, Inc. Los términos de la licencia incluyen los derechos exclusivos para comercializar la tecnología combinada con la secuenciación Sanger. Los planes son desarrollar aplicaciones comerciales que permitan la detección rápida de alta sensibilidad de mutaciones de ADN mitocondrial y somático de bajo nivel. [5]
Alternativas
Hay otras tecnologías disponibles para la detección de mutaciones de ADN minoritarias, y estos métodos se pueden segregar en función de su capacidad para enriquecer y detectar mutaciones conocidas o desconocidas. [6]
Ver también
Referencias
- ^ a b c Li J, Milbury CA, Li C, Makrigiorgos GM (noviembre de 2009). "La secuenciación de Sanger basada en COLD-PCR de dos rondas identifica un nuevo espectro de mutaciones de bajo nivel en el adenocarcinoma de pulmón" . Mutación humana . 30 (11): 1583–90. doi : 10.1002 / humu.21112 . PMC 2784016 . PMID 19760750 .
- ^ a b Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH , Berbeco R, Makrigiorgos GM (mayo de 2008). "Reemplazar la PCR con COLD-PCR enriquece las secuencias de ADN variantes y redefine la sensibilidad de las pruebas genéticas". Medicina de la naturaleza . 14 (5): 579–84. doi : 10.1038 / nm1708 . PMID 18408729 .
- ^ Zuo Z, Chen SS, Chandra PK y col. (Agosto de 2009). "Aplicación de COLD-PCR para una mejor detección de mutaciones de KRAS en muestras clínicas" . Patología moderna . 22 (8): 1023–31. doi : 10.1038 / modpathol.2009.59 . PMID 19430420 .
- ^ a b Li J, Makrigiorgos GM (abril de 2009). "COLD-PCR: una nueva plataforma para la detección de mutaciones altamente mejorada en cáncer y pruebas genéticas". Transacciones de la sociedad bioquímica . 37 (2): 427–32. doi : 10.1042 / BST0370427 . PMID 19290875 .
- ^ Equipo editorial de Laboratorytalk (octubre de 2009). "Transgenomics licencia la tecnología COLD-PCR" . Archivado desde el original el 18 de julio de 2011 . Consultado el 4 de marzo de 2010 .
- ^ Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM (abril de 2009). "Métodos basados en PCR para el enriquecimiento de alelos minoritarios y mutaciones" . Química clínica . 55 (4): 632–40. doi : 10.1373 / clinchem.2008.113035 . PMC 2811432 . PMID 19201784 .