Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas de Prevotella y Francisella 1 o CRISPR / Cas12a (anteriormente denominada Cpf1) es una tecnología de edición de ADN análoga al sistema CRISPR / Cas9 . Cas12a es una endonucleasa guiada por ARN de un sistema CRISPR / Cas de clase II. Este mecanismo inmune adquirido se encuentra en las bacterias Prevotella y Francisella . Previene el daño genético de los virus. Los genes Cas12a están asociados con el locus CRISPR, que codifica una endonucleasa que usa un ARN guía para encontrar y escindir el ADN viral. [1]Cas12a es una endonucleasa más pequeña y simple que Cas9, superando algunas de las limitaciones del sistema CRISPR / Cas9. CRISPR / Cas12a podría tener múltiples aplicaciones, incluido el tratamiento de enfermedades genéticas y afecciones degenerativas. [2]
Descripción
Descubrimiento
CRISPR / Cas12a se encontró al buscar en una base de datos publicada de secuencias genéticas bacterianas fragmentos prometedores de ADN. Su identificación a través de la bioinformática como una proteína del sistema CRISPR, su denominación y un modelo de Markov oculto (HMM) para su detección se proporcionaron en 2012 en una publicación de la base de datos de familias de proteínas TIGRFAMs . Cas12a aparece en muchas especies bacterianas. La última endonucleasa Cas12a que se desarrolló en una herramienta para la edición del genoma se tomó de una de las primeras 16 especies que se sabe que la albergan. [3] Dos enzimas candidatas de Acidaminococcus y Lachnospiraceae muestran una eficiente actividad de edición del genoma en células humanas. [2]
Una versión más pequeña de Cas9 de la bacteria Staphylococcus aureus es una alternativa potencial a Cas12a. [3]
Clasificación
Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. La clase 1 usa varias proteínas Cas junto con los ARN CRISPR (ARNcr) para construir una endonucleasa funcional. Los sistemas CRISPR de clase 2 utilizan una única proteína Cas con un crRNA. Cpf1 se ha identificado recientemente como un sistema CRISPR / Cas de Clase II, Tipo V que contiene una proteína de 1300 aminoácidos. [4]
Estructura
El locus Cas12a contiene un dominio alfa / beta mixto, un RuvC-I seguido de una región helicoidal, un RuvC-II y un dominio similar a un dedo de zinc . [5] proteína El CPF1 tiene una RuvC dominio -como endonucleasa que es similar al dominio RuvC de Cas9. Además, Cpf1 no tiene un dominio de endonucleasa HNH, y el N-terminal de Cas12a no tiene el lóbulo de reconocimiento de hélice alfa de Cas9. [4]
La arquitectura de dominio Cpf1 CRISPR-Cas muestra que Cpf1 es funcionalmente único, y se clasifica como sistema CRISPR de clase 2, tipo V. Los loci Cas12a codifican proteínas Cas1 , Cas2 y Cas4 más similares a los tipos I y III que a los sistemas tipo II. Las búsquedas en bases de datos sugieren la abundancia de proteínas de la familia Cpf1 en muchas especies bacterianas. [4]
Cpf1 funcional no necesita tracrRNA , por lo tanto, solo se requiere crRNA. Esto beneficia la edición del genoma porque Cpf1 no solo es más pequeño que Cas9, sino que también tiene una molécula de sgRNA más pequeña (aproximadamente la mitad de nucleótidos que Cas9). [6]
El complejo Cas12a-crRNA escinde el ADN o ARN diana mediante la identificación de un motivo adyacente a un protoespaciador 5'-YTN-3 ' [7] (donde "Y" es una pirimidina [8] y "N" es cualquier nucleobase ), en contraste con el PAM rico en G dirigido por Cas9. Después de la identificación de PAM, Cas12a introduce una ruptura de doble cadena de ADN similar a un extremo pegajoso de 4 o 5 nucleótidos que sobresalen. [5]
Mecanismo
El sistema CRISPR / Cas12a consta de una enzima Cas12a y un ARN guía que encuentra y coloca el complejo en el lugar correcto de la doble hélice para escindir el ADN diana. La actividad de los sistemas CRISPR / Cpf1 tiene tres etapas: [3]
- Adaptación: las proteínas Cas1 y Cas2 facilitan la adaptación de pequeños fragmentos de ADN en la matriz CRISPR. .
- Formación de crRNA: procesamiento de pre-cr-RNA que producen crRNA maduros para guiar la proteína Cas.
- Interferencia: el Cas12a está unido a un crRNA para formar un complejo binario para identificar y escindir una secuencia de ADN diana.
Cas9 contra Cas12a
Cas9 requiere dos moléculas de ARN para cortar el ADN, mientras que Cas12a necesita una. Las proteínas también cortan el ADN en diferentes lugares, lo que ofrece a los investigadores más opciones al seleccionar un sitio de edición. Cas9 corta ambas hebras en una molécula de ADN en la misma posición, dejando extremos romos . Cas12a deja una hebra más larga que la otra, creando puntas pegajosas . Los extremos pegajosos ayudan en la incorporación de nuevas secuencias de ADN, lo que hace que Cas12a sea más eficiente en la introducción de genes que Cas9. [3] Aunque el sistema CRISPR / Cas9 puede inhabilitar genes de manera eficiente, es un desafío insertar genes o generar un knock-in. [1] Cas12a carece tracrRNA , utiliza un ADN PAM y escinde T-rico a través de un escalonado de DSB de ADN. [6]
En resumen, las diferencias importantes entre los sistemas Cas12a y Cas9 son que Cas12a: [9]
- Reconoce diferentes PAM, lo que permite nuevas posibilidades de focalización.
- Crea extremos pegajosos de 4-5 nt de largo, en lugar de extremos romos producidos por Cas9, mejorando la eficiencia de las inserciones genéticas y la especificidad durante NHEJ o HDR.
- Corta el ADN objetivo más lejos de PAM, más lejos del sitio de corte Cas9, lo que permite nuevas posibilidades para escindir el ADN.
Característica | Cas9 | Cas12a |
---|---|---|
Estructura | Se requieren dos ARN (o 1 transcripción de fusión (crRNA + tracrRNA = gRNA) | Se requiere un ARN |
Mecanismo de corte | Cortes extremos romos | Cortes finales escalonados |
Sitio de corte | Proximal al sitio de reconocimiento | Distal del sitio de reconocimiento |
Sitios de destino | PAM rico en G | PAM rico en T |
Herramientas
Múltiples aspectos influyen en la eficiencia y especificidad del objetivo cuando se usa CRISPR, incluido el diseño de ARN guía. Se han sugerido muchos modelos de diseño para el ARN guía, con herramientas para facilitar el diseño optimizado. Estos incluyen el diseñador SgRNA, CRISPR MultiTargeter, SSFinder. [10] Además, hay anticuerpos comerciales disponibles para su uso en la detección de la proteína Cpf1. [11]
Propiedad intelectual
CRISPR / Cas9 está sujeto a disputas de propiedad intelectual, mientras que CRISPR / Cas12a no tiene los mismos problemas. [2]
Referencias
- ^ a b "La ingeniería genética basada en CRISPR obtiene una patada en el Cas" . Noticias de Meta Science . 2015-09-29. Archivado desde el original el 22 de octubre de 2017 . Consultado el 3 de mayo de 2016 .
- ^ a b c "Incluso CRISPR" . The Economist . ISSN 0013-0613 . Consultado el 3 de mayo de 2016 .
- ^ a b c d Ledford, Heidi (2015). "El sistema CRISPR alternativo podría mejorar la edición del genoma" . Naturaleza . 526 (7571): 17. doi : 10.1038 / nature.2015.18432 . PMID 26432219 .
- ^ a b c Makarova, Kira S., et al. "Una clasificación evolutiva actualizada de los sistemas CRISPR-Cas". Nature Reviews Microbiology (2015).
- ^ a b Zetsche, Bernd; Gootenberg, Jonathan S .; Abudayyeh, Omar O .; Slaymaker, Ian M .; Makarova, Kira S .; Essletzbichler, Patrick; Volz, Sara E .; Joung, Julia; van der Oost, John; Regev, Aviv; Koonin, Eugene V .; Zhang, Feng (octubre de 2015). "Cpf1 es una endonucleasa guiada por ARN única de un sistema CRISPR-Cas de clase 2" . Celular . 163 (3): 759–771. doi : 10.1016 / j.cell.2015.09.038 . PMC 4638220 . PMID 26422227 .
- ^ a b "Cpf1 se mueve en Cas9 para la edición del genoma CRISPR de próxima generación" . epigenie.com . Consultado el 3 de mayo de 2016 .
- ^ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016). "La enzima de escisión de ADN asociada a CRISPR Cas12a también procesa el ARN de CRISPR precursor". Naturaleza . 532 (7600): 517–521. doi : 10.1038 / nature17945 . PMID 27096362 .
- ^ "Códigos de nucleótidos, códigos de aminoácidos y códigos genéticos" . KEGG: Enciclopedia de genes y genomas de Kioto. 15 de julio de 2014 . Consultado el 25 de mayo de 2016 .
- ^ Yamano, T .; Nishimasu, H .; Zetsche, B .; Hirano, H .; Slaymaker, mensajería instantánea; Li, Y .; Fedorova, I .; Nakane, T .; Makarova, KS; Koonin, EV; et al. (2016). "Estructura cristalina de Cpf1 en complejo con ARN guía y ADN diana" . Celular . 165 (4): 949–962. doi : 10.1016 / j.cell.2016.04.003 . PMC 4899970 . PMID 27114038 .
- ^ Graham, Daniel B .; Root, David E. (1 de enero de 2015). "Recursos para el diseño de experimentos de edición de genes CRISPR" . Biología del genoma . 16 : 260. doi : 10.1186 / s13059-015-0823-x . ISSN 1474-760X . PMC 4661947 . PMID 26612492 .
- ^ "Anticuerpo anti-CPF1 (GTX133301) | GeneTex" . www.genetex.com . Consultado el 30 de octubre de 2020 .