El virus del mosaico de la coliflor ( CaMV ) es un miembro del género Caulimovirus , uno de los seis géneros de la familia Caulimoviridae , que son pararetrovirus que infectan las plantas . [1] Los pararetrovirus se replican mediante transcripción inversa al igual que los retrovirus , pero las partículas virales contienen ADN en lugar de ARN . [2]
Virus del mosaico de la coliflor | |
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Clasificación de virus | |
(no clasificado): | Virus |
Reino : | Riboviria |
Reino: | Pararnavirae |
Filo: | Artverviricota |
Clase: | Revtraviricetes |
Pedido: | Ortervirales |
Familia: | Caulimoviridae |
Género: | Caulimovirus |
Especies: | Virus del mosaico de la coliflor |
Definición
El virus del mosaico de la coliflor (CaMV) es un miembro de la familia Caulimoviridae . Esta familia se agrupa junto con los hepadnavirus en el grupo de pararetrovirus debido a su modo de replicación a través de la transcripción inversa de un intermedio de ARN pregenómico.
El CaMV infecta principalmente a plantas de la familia Brassicaceae (como la coliflor y el nabo), pero algunas cepas de CaMV (D4 y W260) también pueden infectar especies de Solanaceae de los géneros Datura y Nicotiana . CaMV induce una variedad de síntomas sistémicos como mosaico, lesiones necróticas en la superficie de las hojas, retraso en el crecimiento y deformación de la estructura general de la planta. Los síntomas exhibidos varían según la cepa viral, el ecotipo del hospedador y las condiciones ambientales. [3]
El CaMV se transmite de manera no circulatoria por especies de pulgón como Myzus persicae . [4] Una vez introducidos dentro de una célula huésped vegetal, los viriones migran a la envoltura nuclear de la célula vegetal.
Estructura
La partícula CaMV es un icosaedro con un diámetro de 52 nm construido a partir de 420 subunidades de proteína de la cápside (CP) dispuestas con una triangulación T = 7, que rodea una cavidad central llena de disolvente. [5] [6]
CaMV contiene una molécula de ADN de doble hebra circular de aproximadamente 8,0 kilobases, interrumpida por mellas que resultan de las acciones de la ARNasa H durante la transcripción inversa. Estas mellas provienen del Met-tRNA y dos cebadores de RNA utilizados en la transcripción inversa. Después de entrar en la célula huésped, estos "cortes" de una sola hebra en el ADN viral se reparan, formando una molécula superenrollada que se une a las histonas. Este ADN se transcribe en un ARN 35S de longitud completa, terminalmente redundante , y un ARN 19S subgenómico.
Genoma
El promotor del ARN 35S es un promotor constitutivo muy fuerte responsable de la transcripción de todo el genoma del CaMV. Es bien conocido por su uso en la transformación de plantas . Provoca altos niveles de expresión genética en plantas dicotiledóneas. Sin embargo, es menos eficaz en monocotiledóneas, especialmente en cereales. Las diferencias de comportamiento probablemente se deban a diferencias en la calidad y / o cantidad de factores regulatorios. Un estudio reciente ha indicado que el promotor CaMV 35S también es funcional en algunas células animales, aunque los elementos promotores utilizados son diferentes de los de las plantas. Si bien este promotor tuvo una baja actividad en comparación con los promotores animales canónicos, los niveles de productos indicadores fueron significativos. Esta observación sugiere que el promotor 35S puede tener potencial para su uso en animales. [7]
El promotor se denominó promotor CaMV 35S ("promotor 35S") porque el coeficiente de sedimentación del transcrito viral, cuya expresión es impulsada naturalmente por este promotor, es 35S. Es uno de los promotores constitutivos de uso general más utilizados. Fue descubierto a principios de la década de 1980 por Chua y colaboradores de la Universidad Rockefeller .
El ARN 35S es particularmente complejo y contiene una secuencia líder de 600 nucleótidos de longitud altamente estructurada con seis a ocho marcos de lectura abiertos cortos (ORF). [8] [9] [10]
A este líder le siguen siete ORF más largos y estrechamente dispuestos que codifican todas las proteínas virales. El mecanismo de expresión de estas proteínas es único, ya que la proteína ORF VI (codificada por el ARN 19S) controla el reinicio de la traducción de los principales marcos de lectura abiertos en el ARN policistrónico 35S, un proceso que normalmente solo ocurre en ARNm bacterianos. La función de TAV depende de su asociación con polisomas y factor de iniciación eucariota eIF3. [11]
- ORF I - P1: proteína de movimiento ( P03545 )
- ORF II - P2: factor de transmisión pulgón / insecto ( P03548 )
- ORF III - P3: proteína asociada al virión (VAP, P03551 ): proteína estructural, capacidades de unión al ADN
- ORF IV - P4: proteína de la cápside (CP, P03542 )
- ORF V - P5: pro-pol ( P03554 ): proteasa, transcriptasa inversa bifuncional y RNasaH
- ORF VI - P6: transactivador / viroplasmina ( P03559 ): formación de cuerpos de inclusión / tráfico; posiblemente otras funciones (ver texto)
- ORF VII / VIII - desconocido (parece que se requiere una nota para la infección, Q83163 , Q83164 )
- Contiene un sitio de unión tRNA -Met
Además de sus funciones con respecto a la activación traslacional y la formación de cuerpos de inclusión, se ha demostrado que P6 interactúa con varias otras proteínas CaMV, como P2 y P3, lo que sugiere que también puede contribuir en algún grado al ensamblaje viral y mediado por áfidos. transmisión. Además, se ha demostrado que P6 se une a P7; investigar las interacciones entre los dos puede ayudar a dilucidar la función aún desconocida de P7. [12]
Otra función de P6 implica la modificación del huésped NO EXPRESOR DE PATOGÉNESIS RELACIONADO 1 ( NPR1 ) durante el curso de la infección. NPR1 es un regulador importante de la señalización dependiente del ácido salicílico (SA) y del ácido jasmónico (JA), y está más estrechamente asociado con la diafonía entre los dos. La modificación de NPR1 sirve para inhibir las respuestas defensivas de las células vegetales al prevenir la señalización dependiente de SA; NPR1 modificado puede traficar adecuadamente al núcleo y unirse al promotor PR-1, pero es incapaz de iniciar la transcripción. Debido a que se requiere NPR1 activo para la acumulación de SA, esto conduce a un mayor agotamiento de SA. Mientras que la regulación de la señalización dependiente de SA por NPR1 modificado con P6 se localiza en el núcleo, la regulación de la señalización dependiente de JA es de naturaleza citoplásmica e implica la vía COI1. A diferencia de la de SA, la señalización dependiente de JA aumenta en presencia de NPR1 modificado. [13]
Replicación
CaMV se replica por transcripción inversa:
- Las partículas virales ingresan a una célula vegetal y no están encapsuladas. En esta etapa, el ADN viral consta de tres fragmentos, uno en la cadena - (α) y dos en la cadena + (β y γ) que se ensamblan de manera imperfecta en un genoma circular con tres espacios o discontinuidades (D1, D2 y D3 ).
- El ADN viral entra en el núcleo donde se rellenan las discontinuidades. En este punto, el ADN viral también se asocia con las histonas del huésped , formando un minicromosoma (no mostrado).
- La ARN polimerasa dependiente del ADN del huésped transcribe desde el promotor 35S en todo el genoma viral, superando al promotor 35S. (Esto crea dos copias del promotor 35S en el ARN resultante). La transcripción también se inicia en el promotor 19S (no mostrado).
- Los ARN virales pasan al citoplasma del hospedador donde se transcriben.
- El extremo 3 'de un ARNt fMet se hibrida con un sitio correspondiente a la discontinuidad 1 (D1) cerca del extremo 5' del ARN 35S.
- El tRNA fMet inicia la síntesis, mediante la transcriptasa inversa viral (codificada por ORF V), de una nueva cadena α.
- La ARNasa H elimina el ARN del dúplex ADN-ARN, dejando atrás el ADN.
- Este nuevo ADN se une al promotor 35S en el extremo 3 'de la plantilla de ARN y la síntesis de la hebra α de ADN continúa y la ARNasa H continúa degradando el ARN complejado con el ADN.
- Se completa la síntesis de la hebra α. La actividad de la ARNasa H expone las regiones ricas en purina en la posición de discontinuidad 3 (D3), que inicia la síntesis de la cadena de ADN γ.
- La actividad de la ARNasa H expone las regiones ricas en purina en la posición de discontinuidad 2 (D2), que inicia la síntesis de la cadena de ADN β. Cuando la nueva hebra γ de ADN alcanza el extremo 5 ′ de la nueva hebra α, cambia al extremo 5 ′ de la nueva hebra α, recreando la discontinuidad 1 (D1). Cuando la nueva hebra γ de ADN alcanza el extremo 5 'de la nueva hebra β, desplaza el cebador y parte de la hebra β recién sintetizada, lo que da como resultado la recreación de la discontinuidad 2 (D2). Cuando la nueva hebra β de ADN alcanza el extremo 5 'de la nueva hebra γ, desplaza el cebador y parte de la hebra γ recién sintetizada, lo que da como resultado la recreación de la discontinuidad 3 (D3).
En este punto, el nuevo genoma viral puede empaquetarse en cápsides y liberarse de la célula o pueden transportarse mediante proteínas de movimiento a una célula adyacente no infectada. [14]
El promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) se utiliza en la mayoría de los cultivos transgénicos para activar genes extraños que se han insertado artificialmente en la planta huésped. Se inserta en plantas transgénicas en una forma que es diferente a la que se encuentra cuando está presente en sus hospedantes naturales de plantas Brassica . Esto le permite operar en una amplia gama de entornos de organismos hospedadores que de otro modo no serían posibles.
CaMV contiene aproximadamente 8 kb de genoma de ADN de doble hebra y produce partículas esféricas. Las infecciones por CaMV son sistémicas e incluso su ADN es infeccioso cuando se inocula en superficies de plantas desgastadas. El genoma del CaMV tiene 8 genes muy empaquetados, de los cuales solo dos genes pequeños, los genes II y VII, no son esenciales; como resultado, solo estos dos genes se pueden reemplazar / eliminar sin pérdida de infectividad. Además, los genomas de CaMV modificados que superan el tamaño del genoma natural (8024 pb) incluso en unos pocos cientos de pb no se empaquetan en viriones. Estos dos factores limitan seriamente el tamaño del inserto de ADN clonable en CaMV. El gen DHFR de la dihidrofolato reductasa bacteriana se ha clonado con éxito en el genoma del CaMV, en lugar del gen II, y se ha expresado con éxito en plantas.
Mecanismos moleculares de la transmisión de CaMV mediada por vectores
El virus se adquiere de un huésped infectado durante la alimentación por el pulgón vector. Para que ocurra, un complejo transmisible se compone de viriones y proteína P2 localizados en los estiletes del vector. El dominio P2 N-terminal reconoce un receptor de proteína ubicado en la punta del estilete y el dominio P2 C-terminal se une a los viriones decorados con P3. [15]
El modo de adquisición por parte del vector está controlado por el tejido y la localización intracelular específica de P2. Esta proteína solo se encuentra en las células de la epidermis y el parénquima. Además, en estas células, P2 se localiza en cuerpos de inclusión lucientes de electrones virales únicos (ELIB). [16] En las células hospedadoras, las proteínas virales P2 y P3 se producen primero en numerosas fábricas virales (cuerpos de inclusión densos en electrones) y luego se exportan y colocalizan con microtúbulos, antes de concentrarse en ELIB. CaMV usa específicamente los microtúbulos para formar el cuerpo transmisible y así permitir la transmisión del vector. [17] La caracterización molecular completa y el estudio de este virus no se llevaron más allá.
Evasión de las defensas de las plantas
El virus del mosaico de la coliflor posee una serie de mecanismos que le permiten contrarrestar las defensas de las células de la planta huésped. Si bien el ARN 35S pregenómico es responsable de la replicación del genoma mediante la transcriptasa inversa, también contiene una secuencia líder no codificante de 600 pares de bases que sirve como un ARNm importante para la producción de factores involucrados en la contradefensa viral. Varios huéspedes de CaMV poseen pequeños mecanismos de silenciamiento viral basados en ARN que sirven para limitar la infección viral. Los productos de la secuencia de 600 pb antes mencionada son ARN víricos pequeños (vsRNA) de 21, 22 y 24 nucleótidos de longitud que sirven como señuelos, efectores de unión e inactivación de la maquinaria de silenciamiento del huésped, como Argonaute 1 ( AGO1 ). Como prueba de principio, la sobreexpresión experimental de estos vsRNAs permite una mayor acumulación viral en plantas infectadas. [18]
Preocupaciones sobre el uso del promotor CaMV 35S en plantas transgénicas
Recientemente, se han planteado algunas preocupaciones sobre el uso del promotor CaMV 35S para la expresión en plantas transgénicas porque existe una superposición de secuencias entre este promotor y las secuencias codificantes de P6. Cincuenta y cuatro eventos transgénicos certificados para su liberación en los EE. UU. Contienen hasta 528 pb de ORF VI (que codifican los dominios C-terminales de P6). [19] Como P6 es una proteína multifuncional cuya gama completa de funciones se desconoce, existe cierta preocupación de que la expresión de uno o más de sus dominios pueda tener consecuencias imprevistas en los organismos transgénicos. Estudios recientes han intentado determinar qué longitud del promotor CaMV 35S tiene la menor posibilidad de producir dominios P6 inadvertidamente, mientras que aún conserva la actividad promotora completa. Como era de esperar, el uso de longitudes de promotor más cortas disminuye el número de dominios P6 incluidos y también disminuye la probabilidad de efectos no deseados. [19]
Referencias
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enlaces externos
- Virus del mosaico de la coliflor
- "El promotor CaMV 35S" . patentlens.net . Archivado desde el original el 7 de enero de 2008.