Los ensayos de quimiotaxis son herramientas experimentales para la evaluación de la capacidad quimiotáctica de células procariotas o eucariotas . Se ha desarrollado una amplia variedad de técnicas. Algunas técnicas son cualitativas , lo que permite a un investigador determinar aproximadamente la afinidad quimiotáctica de una célula por un analito, mientras que otras son cuantitativas , lo que permite una medición precisa de esta afinidad.
Control de calidad
En general, el requisito más importante es calibrar el tiempo de incubación del ensayo tanto para la célula modelo como para el ligando a evaluar. Un tiempo de incubación demasiado corto da como resultado que no haya células en la muestra, mientras que un tiempo demasiado largo perturba los gradientes de concentración y mide más respuestas quimiocinéticas que quimiotácticas .
Las técnicas más utilizadas se agrupan en dos grupos principales:
Técnicas en placa de agar
Esta forma de evaluación trata con agar-agar o gelatina que contiene capas semisólidas preparadas antes del experimento. Se cortan pequeños pocillos en la capa y se llenan con células y la sustancia problema. Las células pueden migrar hacia el gradiente químico en la capa semisólida o también debajo de la capa. Algunas variaciones de la técnica también se refieren a pozos y canales paralelos conectados por un corte al comienzo del experimento (técnica PP). La disposición radial de la técnica de PP (3 o más canales) proporciona la posibilidad de comparar la actividad quimiotáctica de diferentes poblaciones de células o estudiar la preferencia entre ligandos. [1]
Recuento de células: las células que responden positivamente se pueden contar desde el frente de las células que migran, después de la tinción o en condiciones nativas en un microscopio óptico.
Técnicas de dos cámaras
Cámara de Boyden
Las cámaras aisladas por filtros son herramientas adecuadas para la determinación precisa del comportamiento quimiotáctico. El tipo pionero de estas cámaras fue construido por Boyden. [2] Las células móviles se colocan en la cámara superior, mientras que el líquido que contiene la sustancia de ensayo se llena en la inferior. El tamaño de las células móviles a investigar determina el tamaño de los poros del filtro; es fundamental elegir un diámetro que permita la transmigración activa. Para modelar condiciones in vivo , varios protocolos prefieren la cobertura del filtro con moléculas de matriz extracelular ( colágeno , elastina , etc.). La eficiencia de las mediciones se incrementó mediante el desarrollo de cámaras multipocillo (por ejemplo, NeuroProbe), donde se evalúan 24, 96, 384 muestras en paralelo. La ventaja de esta variante es que se ensayan varios paralelos en condiciones idénticas.
Cámaras de puente
En otro entorno, las cámaras están conectadas una al lado de la otra horizontalmente (cámara de Zigmond) [3] o como anillos concéntricos en un portaobjetos (cámara de Dunn) [4] El gradiente de concentración se desarrolla en un estrecho puente de conexión entre las cámaras y el número de células migratorias es también contados en la superficie del puente por microscopio óptico. En algunos casos, el puente entre las dos cámaras se llena con agar y las células tienen que " deslizarse " en esta capa semisólida.
Técnicas capilares
Algunas técnicas capilares también proporcionan una disposición similar a una cámara, sin embargo, no hay filtro entre las células y la sustancia de prueba. [5] Los resultados cuantitativos se obtienen con el tipo de pozos múltiples de esta sonda utilizando pipetas de 4-8-12 canales. La precisión de la pipeta y el aumento del número de muestras que se ejecutan en paralelo es la gran ventaja de esta prueba. [6]
Recuento de células: las células que responden positivamente se cuentan desde la cámara inferior (tiempo de incubación prolongado) o desde el filtro (tiempo de incubación corto). Para la detección de células se utilizan técnicas de tinción generales (por ejemplo , azul tripán ) o sondas especiales (por ejemplo, detección de mt-deshidrogenasa con ensayo MTT). También se utilizan células marcadas (por ejemplo, fluorocromos ), en algunos ensayos las células se marcan durante la transmigración del filtro.
Otras tecnicas
Además de las dos familias de técnicas más comúnmente utilizadas mencionadas anteriormente, se desarrolló una amplia gama de protocolos para medir la actividad quimiotáctica. Algunos de ellos son solo cualitativos, como las pruebas de agregación, donde se colocan pequeños trozos de agar o filtros en un portaobjetos y se mide la acumulación de células alrededor.
En otra técnica semicuantitativa, las células se superponen con la sustancia de ensayo y se registran los cambios en la opalescencia del compartimento originalmente libre de células durante el tiempo de incubación. [7]
La tercera técnica cualitativa de uso frecuente es el laberinto en T y sus adaptaciones para microplacas. En la versión original, un recipiente perforado en una clavija está lleno de celdas. Luego, la clavija se retuerce y las células entran en contacto con otros dos recipientes llenos de diferentes sustancias. La incubación se detiene restableciendo la clavija y se cuenta el número de células de los contenedores. [8]
Además, últimamente, [ ¿cuándo? ] Los dispositivos de microfluidos se han utilizado cada vez con más frecuencia para realizar pruebas cuantitativas y precisas de quimiotaxis. [9] [10] [11]
Referencias
- ^ Kőhidai L. (1995). "Método para la determinación de quimioatracción en Tetrahymena pyriformis". Curr Microbiol . 30 (4): 251–3. doi : 10.1007 / BF00293642 . PMID 7765899 . S2CID 28989380 .
- ^ Boyden, SV (1962). "El efecto quimiotáctico de mezclas de anticuerpos y antígenos en leucocitos polimorfonucleares" . J Exp Med . 115 (3): 453–66. doi : 10.1084 / jem.115.3.453 . PMC 2137509 . PMID 13872176 .
- ^ Zigmond SH (1977). "Capacidad de los leucocitos polimorfonucleares para orientarse en gradientes de factores quimiotácticos" . Revista de biología celular . 75 (2): 606–616. CiteSeerX 10.1.1.336.4181 . doi : 10.1083 / jcb.75.2.606 . PMC 2109936 . PMID 264125 .
- ^ Zicha D .; Dunn GA; Brown AF (1991). "Una nueva cámara de quimiotaxis de visión directa". J Cell Sci . 99 : 769–75. PMID 1770004 .
- ^ Leick V .; Helle J. (1983). "Un ensayo cuantitativo para la quimiotaxis de ciliados". Anal Biochem . 135 (2): 466–9. doi : 10.1016 / 0003-2697 (83) 90713-3 . PMID 6660520 .
- ^ Kőhidai, L., Lemberkovits, É. y Csaba, G. (1995). "Respuestas quimiotácticas dependientes de moléculas de Tetrahymena pyriformis provocadas por aceites volátiles". Acta Protozool . 34 : 181–5.CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Koppelhus U .; Hellung-Larsen P .; Leick V. (1994). "Un ensayo cuantitativo mejorado para la quimiocinesis en Tetrahymena". Biol Bull . 187 (1): 8-15. doi : 10.2307 / 1542160 . JSTOR 1542160 . PMID 7918798 .
- ^ Van Houten J .; Martel E .; Kasch T. (1982). "Análisis cinético de la quimiocinesis de Paramecium". J Protozool . 29 (2): 226-30. doi : 10.1111 / j.1550-7408.1982.tb04016.x . PMID 7097615 .
- ^ Seymour JR; JR Ahmed; Marcos S. R (2008). "Un ensayo de quimiotaxis de microfluidos para estudiar el comportamiento microbiano en la difusión de parches de nutrientes". Limnología y Oceanografía: métodos . 6 (9): 477–887. doi : 10.4319 / lom.2008.6.477 . hdl : 10453/8517 .
- ^ Zhang C .; {\ i {} et al.} (2013). "Un ensayo de quimiotaxis sensible utilizando un dispositivo microfluídico novedoso". {\ i {} BioMed Research International} . 8 : 8211–8.
- ^ Ahmed T .; himizu TS; Stocker R. (2010). "Microfluídicos para quimiotaxis bacteriana". {\ i {} Biología integrativa} . 2 (11-12): 604-29. doi : 10.1039 / c0ib00049c . hdl : 1721,1 / 66851 . PMID 20967322 .
enlaces externos
- Quimiotaxis
- Puerta de enlace de migración celular
- Ensayo citométrico de quimiotaxis y migración celular
- Herramienta gratuita basada en ImageJ para analizar procesos quimiotácticos
- Herramienta de análisis de imágenes de quimiotaxis