La tecnología de sonda cíclica (CPT) es una técnica de biología molecular para detectar secuencias de ADN específicas . CPT opera en condiciones isotérmicas . En algunas aplicaciones, CPT ofrece una alternativa a la PCR . Sin embargo, a diferencia de la PCR, la CPT no genera múltiples copias del ADN diana en sí, y la amplificación de la señal es lineal, en contraste con la amplificación exponencial del ADN diana en la PCR. CPT utiliza una sonda quimérica específica de secuencia que se hibrida con una secuencia de ADN diana complementaria y se convierte en un sustrato para la ARNasa H. La escisión se produce en los enlaces internucleotídicos de ARN y da como resultado la disociación de la sonda de la diana, lo que la hace disponible para la siguiente molécula de sonda. [1] Se han desarrollado sistemas electrocinéticos integrados para su uso en CPT. [2]
Investigacion
La tecnología de sonda cíclica utiliza una sonda de ácido nucleico quimérica para detectar la presencia de una secuencia de ADN particular . La sonda quimérica consta de un segmento de ARN intercalado entre dos segmentos de ADN. El segmento de ARN contiene 4 nucleótidos purínicos contiguos . Las sondas deben tener menos de 30 nucleótidos de longitud y estar diseñadas para minimizar las interacciones entre sondas y entre sondas. [3]
Proceso
La tecnología de sonda cíclica utiliza un proceso isotérmico cíclico que comienza con la hibridación de la sonda quimérica con el ADN diana. Una vez hibridado, la sonda se convierte en un sustrato adecuado para la RNasa H . La RNasa H, una endonucleasa , escinde la porción de ARN de la sonda, dando como resultado dos fragmentos quiméricos. La temperatura de fusión (T m ) de los fragmentos recién escindidos es más baja que la temperatura de fusión de la sonda original. Debido a que la reacción de CPT se mantiene isotérmicamente justo por encima del punto de fusión de la sonda original, los fragmentos escindidos se disocian del ADN diana. Una vez disociado, el ADN diana es libre de hibridar con una nueva sonda, comenzando el ciclo nuevamente. [3] [4]
Una vez que los fragmentos se han escindido y disociado, se vuelven detectables. Una estrategia común para detectar los fragmentos implica la fluorescencia . Con este método, se une un marcador fluorescente al extremo 5 'de la sonda y se une un extintor al extremo 3' de la sonda. [4] [5] Cuando la RNasa H escinde la sonda, el extintor y el marcador fluorescente se separan, aumentando la intensidad del marcador fluorescente. Los fragmentos escindidos se pueden detectar alternativamente mediante amplificación (p. Ej., PCR ) o una modificación adicional para permitir otros medios químicos de detección. [6]
Cuando se trabaja con pequeñas concentraciones de ADN diana, el protocolo CPT se puede modificar para aumentar la especificidad y la eficiencia. Se ha demostrado que el aumento del tiempo asignado mejora la eficacia de la escisión de la sonda. [4] Se ha demostrado que tanto el aumento de las concentraciones de RNasa H como el uso de una sonda que no es propensa a interacciones entre sondas e intra-sondas aumentan la especificidad. [3]
Ventajas
Debido a que la tecnología de sonda cíclica no implica la amplificación del ADN diana, la CPT tiene un riesgo menor de contaminación cruzada que la PCR. [3] [4] Además, la CPT es más rápida que la PCR [4] y no requiere un termociclador especializado . CPT tampoco requiere ejecutar productos CPT en un gel .
Desventajas
La CPT requiere sondas quiméricas especializadas, lo que hace que los ensayos de CPT sean más costosos que la PCR. [5] Debido a que las sondas CPT son tan específicas, se debe diseñar una nueva sonda para cada ensayo único, lo que aumenta aún más el costo. La implementación clínica se ve obstaculizada financieramente, pero también está limitada por la posibilidad de muestras que contengan ARNasas inespecíficas distintas de la ARNasa H. [3]
Aplicaciones
La CPT se puede utilizar para detectar secuencias de ADN específicas y, por extensión, genotipos específicos . Por ejemplo, la CPT se puede utilizar para distinguir los productos transgénicos de los productos no transgénicos. [5] Clínicamente, la CPT se puede utilizar como una alternativa al cultivo celular para detectar la resistencia antibacteriana de un patógeno. [4]
CPT, en su esencia, detecta si una secuencia específica está presente en una muestra. Pero debido a que las sondas escindidas se acumulan siguiendo una cinética de velocidad lineal , se puede cuantificar la cantidad de ADN diana. En consecuencia, la CPT se ha utilizado para cuantificar el número de repeticiones no codificantes en organismos. [3]
CPT se puede utilizar junto con otras tecnologías, como balizas moleculares y qPCR . [7]
Referencias
- ^ Bhatt R, Scott B, Whitney S, Bryan RN, Cloney L, Lebedev A (1999). "Detección de ácidos nucleicos mediante tecnología de sonda cíclica sobre partículas magnéticas: alta sensibilidad y facilidad de separación". Nucleósidos y nucleótidos . 18 (6–7): 1297–9. doi : 10.1080 / 07328319908044696 . PMID 10474219 .
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