Las balizas moleculares , o sondas de baliza molecular , son sondas de hibridación de oligonucleótidos que pueden informar la presencia de ácidos nucleicos específicos en soluciones homogéneas. Las balizas moleculares son horquilla moléculas formada con el un internamente inactivó fluoróforo , cuya fluorescencia se restaura cuando se unen a una secuencia de ácido nucleico diana. Este es un nuevo método no radiactivo para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos. Son útiles en situaciones en las que no es posible o deseable aislar los híbridos sonda-diana de un exceso de sondas de hibridación.
Sondas de baliza molecular
Una sonda de baliza molecular típica tiene una longitud de 25 nucleótidos . [ cita requerida ] Los 15 nucleótidos del medio son complementarios al ADN o ARN diana y no se emparejan entre sí, mientras que los cinco nucleótidos en cada extremo son complementarios entre sí en lugar del ADN diana. Una estructura típica de baliza molecular se puede dividir en 4 partes: 1) bucle, una región de 18-30 pares de bases de la baliza molecular que es complementaria a la secuencia objetivo; 2) tallo formado por la unión a ambos extremos del bucle de dos oligonucleótidos cortos (de 5 a 7 residuos de nucleótidos) que son complementarios entre sí; 3) fluoróforo 5 'en el extremo 5' de la baliza molecular, se une covalentemente un tinte fluorescente; 4) Tinte extintor 3 '(no fluorescente) que está unido covalentemente al extremo 3' de la baliza molecular. Cuando la baliza tiene forma de bucle cerrado, el extintor reside en la proximidad del fluoróforo, lo que da como resultado la extinción de la emisión fluorescente de este último.
Si el ácido nucleico a detectar es complementario de la hebra en el bucle, se produce el evento de hibridación . El dúplex formado entre el ácido nucleico y el bucle es más estable que el del tallo porque el dúplex anterior implica más pares de bases. Esto provoca la separación del tallo y, por tanto, del fluoróforo y del extintor. Una vez que el fluoróforo ya no está al lado del extintor, la iluminación del híbrido con luz da como resultado la emisión fluorescente. La presencia de la emisión informa que se ha producido el evento de hibridación y, por tanto, la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra de prueba.
Uso en ingeniería celular
Se informó que las sondas de oligonucleótidos de señalización fluorogénica se utilizan para detectar y aislar células que expresan uno o más genes deseados, incluida la producción de líneas celulares estables multigénicas que expresan el canal de sodio epitelial heteromultimérico (αβγ-ENaC), el canal iónico de sodio regulado por voltaje 1.7 (NaV1.7). -αβ1β2), cuatro combinaciones únicas de subunidades del canal iónico del receptor del ácido γ-aminobutírico A (GABAA) α1β3γ2s, α2β3γ2s, α3β3γ2s y α5β3γ2s, regulador de la conductancia de la fibrosis quística (CFTR), CFTR-Δ508 y dos receptores acoplados a proteína G (GPCR). [1]
Síntesis
Las balizas moleculares son oligonucleótidos sintéticos cuya preparación está bien documentada. Además del conjunto convencional de fosforamiditas de nucleósidos , la síntesis también requiere un soporte sólido derivatizado con un inhibidor y un bloque de construcción de fosforamidita diseñado para la unión de un tinte fluorescente protegido.
El primer uso del término balizas moleculares, síntesis y demostración de función fue en 1996. [2]
Tecnologías de ensayo homogéneas alternativas
- Ensayo TaqMan de 5'-nucleasa [3]
- Sondas de oligonucleótidos fluorescentes sensibles a la hibridación controladas por excitones (ECHO). [4]
- Sondas de doble hibridación (LightCycler®)
- Sondas Scorpions®
- Sondas LUX (luz sobre extensión)
- Ensayos de tintes de unión a ADN (p. Ej., SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus, etc.)
Aplicaciones
Referencias
- ^ Shekdar K, Langer J, Venkatachalan S, Schmid L, Anobile J, Shah P, et al. (Marzo de 2021). "Método de ingeniería celular utilizando sondas de señalización de oligonucleótidos fluorogénicos y citometría de flujo" . Cartas de biotecnología . doi : 10.1007 / s10529-021-03101-5 . PMC 7937778 . PMID 33683511 .
- ^ Tyagi S, Kramer FR (marzo de 1996). "Balizas moleculares: sondas que emiten fluorescencia tras la hibridación". Biotecnología de la naturaleza . 14 (3): 303–8. doi : 10.1038 / nbt0396-303 . PMID 9630890 . S2CID 27010207 .
- ^ a b c Täpp I, Malmberg L, Rennel E, Wik M, Syvänen AC (abril de 2000). "Puntuación homogénea de polimorfismos de un solo nucleótido: comparación del ensayo TaqMan de 5'-nucleasa y sondas de baliza molecular" . BioTechniques . 28 (4): 732–8. doi : 10.2144 / 00284rr02 . PMID 10769752 .
- ^ Okamoto A (diciembre de 2011). "Sondas ECHO: un concepto de control de fluorescencia para la detección práctica de ácidos nucleicos". Reseñas de la Sociedad Química . 40 (12): 5815-28. doi : 10.1039 / c1cs15025a . PMID 21660343 .