La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta de biología molecular comúnmente utilizada para amplificar el ADN y varias técnicas para la optimización de la PCR que han sido desarrolladas por biólogos moleculares para mejorar el rendimiento de la PCR y minimizar los fallos.
Contaminación y PCR
El método de PCR es extremadamente sensible y requiere solo unas pocas moléculas de ADN en una sola reacción para la amplificación en varios órdenes de magnitud. Por lo tanto, se requieren medidas adecuadas para evitar la contaminación de cualquier ADN presente en el entorno del laboratorio ( bacterias , virus o fuentes humanas). Debido a que los productos de amplificaciones de PCR anteriores son una fuente común de contaminación, muchos laboratorios de biología molecular han implementado procedimientos que implican dividir el laboratorio en áreas separadas. [1] Un área de laboratorio está dedicada a la preparación y manipulación de reactivos pre-PCR y la configuración de la reacción de PCR, y otra área al procesamiento posterior a la PCR, como la electroforesis en gel o la purificación del producto de PCR. Para la configuración de las reacciones de PCR, muchos procedimientos operativos estándar implican el uso de pipetas con puntas de filtro y guantes de laboratorio nuevos y, en algunos casos, una cabina de flujo laminar con lámpara UV como estación de trabajo (para destruir cualquier formación de neomultímeros extra ). La PCR se evalúa de forma rutinaria frente a una reacción de control negativo que se configura de manera idéntica a la PCR experimental, pero sin ADN molde, y se realiza junto con la PCR experimental.
Horquillas
Las estructuras secundarias en el ADN pueden resultar en el pliegue o anudamiento de la plantilla o cebadores de ADN, lo que lleva a una disminución del rendimiento del producto o al fracaso de la reacción. Las horquillas , que consisten en pliegues internos causados por el apareamiento de bases entre nucleótidos y repeticiones invertidas dentro del ADN monocatenario, son estructuras secundarias comunes y pueden resultar en PCR fallidas.
Por lo general, el diseño de cebadores que incluye una verificación de posibles estructuras secundarias en los cebadores, o la adición de DMSO o glicerol a la PCR para minimizar las estructuras secundarias en la plantilla de ADN, [2] se utilizan en la optimización de las PCR que tienen un historial de fallas. debido a la sospecha de horquillas de ADN.
Errores de polimerasa
La polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa 3 'a 5' . Por lo tanto, Taq no tiene actividad de lectura a prueba de errores, que consiste en la escisión de cualquier base nucleotídica recientemente incorporada incorrectamente de la cadena de ADN naciente (es decir, que se extiende) que no coincide con su base opuesta en la cadena de ADN complementaria. La falta de corrección de pruebas de 3 ′ a 5 ′ de la enzima Taq da como resultado una alta tasa de error (mutaciones por nucleótido por ciclo) de aproximadamente 1 en 10,000 bases, lo que afecta la fidelidad de la PCR, especialmente si ocurren errores al principio de la PCR con bajas cantidades de material de partida, lo que provoca la acumulación de una gran proporción de ADN amplificado con secuencia incorrecta en el producto final. [3]
Se han hecho disponibles varias ADN polimerasas de "alta fidelidad", que tienen actividad exonucleasa 3 'a 5' modificada, que permiten una amplificación más precisa para su uso en PCR para secuenciar o clonar productos. Ejemplos de polimerasas con actividad exonucleasa 3 'a 5' incluyen: ADN polimerasa KOD , una forma recombinante de Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, que se extrae de Thermococcus litoralis ; Pfu ADN polimerasa , que se extrae de Pyrococcus furiosus ; y Pwo, que se extrae de Pyrococcus woesii . [4]
Concentración de magnesio
Se requiere magnesio como cofactor para la ADN polimerasa termoestable. La polimerasa Taq es una enzima dependiente de magnesio y determinar la concentración óptima a utilizar es fundamental para el éxito de la reacción de PCR. [5] Algunos de los componentes de la mezcla de reacción, como la concentración del molde, los dNTP y la presencia de agentes quelantes ( EDTA ) o proteínas, pueden reducir la cantidad de magnesio libre presente, reduciendo así la actividad de la enzima. [6] Los cebadores que se unen a sitios de plantilla incorrectos se estabilizan en presencia de concentraciones excesivas de magnesio y, por lo tanto, dan como resultado una disminución de la especificidad de la reacción. Las concentraciones excesivas de magnesio también estabilizan el ADN de doble hebra y evitan la desnaturalización completa del ADN durante la PCR, lo que reduce el rendimiento del producto. [5] [6] La descongelación inadecuada de MgCl 2 puede resultar en la formación de gradientes de concentración dentro de la solución de cloruro de magnesio suministrada con la ADN polimerasa y también contribuye a muchos experimentos fallidos. [6]
Tamaño y otras limitaciones
La PCR funciona fácilmente con una plantilla de ADN de hasta dos a tres mil pares de bases de longitud. Sin embargo, por encima de este tamaño, los rendimientos del producto a menudo disminuyen, ya que con el aumento de la longitud, los efectos estocásticos , como la terminación prematura por parte de la polimerasa, comienzan a afectar la eficacia de la PCR. Es posible amplificar piezas más grandes de hasta 50.000 pares de bases con un ciclo de calentamiento más lento y polimerasas especiales. Estas son polimerasas fusionadas con una proteína de unión al ADN que mejora la procesividad, lo que mejora la adherencia de la polimerasa al ADN. [7] [8]
Otras propiedades valiosas de las polimerasas quiméricas TopoTaq y PfuC2 incluyen termoestabilidad mejorada, especificidad y resistencia a contaminantes e inhibidores . [9] [10] Fueron diseñados utilizando los dominios de unión de ADN únicos de hélice-horquilla-hélice (HhH) de la topoisomerasa V [11] del hipertermófilo Methanopyrus kandleri . Las polimerasas quiméricas superan muchas limitaciones de las enzimas nativas y se utilizan en la amplificación por PCR directa de cultivos celulares e incluso muestras de alimentos , evitando así los laboriosos pasos de aislamiento del ADN. Una robusta actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa híbrida TopoTaq ayuda a resolver los problemas de PCR que pueden ser causados por horquillas y hélices dobles cargadas de G. Las hélices con un alto contenido de GC poseen una temperatura de fusión más alta, lo que a menudo afecta a la PCR, según las condiciones. [12]
Imprimación inespecífica
La unión no específica de cebadores ocurre con frecuencia y puede ocurrir por varias razones. Estos incluyen secuencias repetidas en la plantilla de ADN, unión no específica entre el cebador y la plantilla, contenido de GC alto o bajo en la plantilla o unión incompleta del cebador, dejando el extremo 5 'del cebador sin unir a la plantilla. También es común la unión no específica de cebadores degenerados . Puede usarse la manipulación de la temperatura de recocido y la concentración de iones de magnesio para aumentar la especificidad. Por ejemplo, concentraciones más bajas de magnesio u otros cationes pueden prevenir interacciones de cebadores inespecíficos, permitiendo así una PCR exitosa. Una enzima polimerasa de "inicio en caliente" cuya actividad se bloquea a menos que se caliente a una temperatura alta (p. Ej., 90-98 ° C) durante el paso de desnaturalización del primer ciclo, se usa comúnmente para prevenir el cebado inespecífico durante la preparación de la reacción en temperaturas más bajas. Las PCR de inicio en caliente mediadas químicamente requieren temperaturas más altas y tiempos de incubación más largos para la activación de la polimerasa, en comparación con las PCR de inicio en caliente basadas en anticuerpos o aptámeros. [ cita requerida ]
Otros métodos para aumentar la especificidad incluyen PCR anidada y PCR Touchdown .
Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño del cebador. [13]
La reacción en cadena de la polimerasa touchdown o la reacción en cadena de la polimerasa estilo touchdown es un método de reacción en cadena de la polimerasa mediante el cual los cebadores evitarán la amplificación de secuencias inespecíficas. La temperatura de hibridación durante una reacción en cadena de la polimerasa determina la especificidad de la hibridación del cebador. El punto de fusión del cebador establece el límite superior de la temperatura de recocido. A temperaturas justo por debajo de este punto, solo se producirá un emparejamiento de bases muy específico entre la imprimación y la plantilla. A temperaturas más bajas, los cebadores se unen de forma menos específica. La unión de cebadores inespecíficos oscurece los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa, ya que las secuencias inespecíficas con las que se aparean los cebadores en las primeras etapas de amplificación "anularán" cualquier secuencia específica debido a la naturaleza exponencial de la amplificación de polimerasa.
Los primeros pasos de un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa de contacto tienen altas temperaturas de recocido. La temperatura de recocido se reduce en incrementos para cada conjunto posterior de ciclos (el experimentador elige el número de ciclos individuales y los incrementos de disminución de temperatura). El cebador se templará a la temperatura más alta que sea menos permisiva de unión no específica que pueda tolerar. Por tanto, la primera secuencia amplificada es la que se encuentra entre las regiones de mayor especificidad de cebador; lo más probable es que esta sea la secuencia de interés. Estos fragmentos se amplificarán adicionalmente durante rondas posteriores a temperaturas más bajas y competirán con las secuencias inespecíficas a las que los cebadores pueden unirse a esas temperaturas más bajas. Si el cebador inicialmente (durante las fases de temperatura más alta) se une a la secuencia de interés, se pueden realizar rondas posteriores de reacción en cadena de la polimerasa sobre el producto para amplificar aún más esos fragmentos.
Dímeros de imprimación
El recocido del extremo 3 'de un cebador consigo mismo o con el segundo cebador puede provocar la extensión del cebador, lo que da como resultado la formación de los denominados dímeros del cebador, visibles como bandas de bajo peso molecular en geles de PCR . [14] La formación del dímero del cebador a menudo compite con la formación del fragmento de ADN de interés, y puede evitarse utilizando cebadores diseñados de tal manera que carecen de complementariedad, especialmente en los extremos 3 ', consigo mismo o con el otro cebador utilizado en la reacción. Si el diseño del cebador está limitado por otros factores y si se producen dímeros del cebador, los métodos para limitar su formación pueden incluir la optimización de la concentración de MgCl 2 o el aumento de la temperatura de hibridación en la PCR. [14]
Desoxinucleótidos
Los desoxinucleótidos (dNTP) pueden unirse a los iones Mg 2+ y, por lo tanto, afectar la concentración de iones de magnesio libres en la reacción. Además, cantidades excesivas de dNTP pueden aumentar la tasa de error de la ADN polimerasa e incluso inhibir la reacción. [5] [6] Un desequilibrio en la proporción de los cuatro dNTP puede resultar en una incorporación incorrecta en la cadena de ADN recién formada y contribuir a una disminución en la fidelidad de la ADN polimerasa. [15]
Referencias
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Se tuvo sumo cuidado en todos los ensayos para evitar la contaminación cruzada tanto de las muestras de ácido nucleico a analizar como de las mezclas de reacción; tales medidas incluyeron la preparación de ácidos nucleicos en un laboratorio separado de aquellos en los que se establecieron ensayos de PCR o transcripción inversa (RT) -PCR y el uso de ocho campanas biológicas diferentes, cada una en un laboratorio diferente, para preparar las reacciones.
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