Las DARPins (un acrónimo de proteínas de repetición de anquirina diseñadas ) son proteínas miméticas de anticuerpos modificadas genéticamente que típicamente exhiben una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad . Se derivan de proteínas de repetición de anquirina natural , una de las clases más comunes de proteínas de unión en la naturaleza, que son responsables de diversas funciones como la señalización celular, la regulación y la integridad estructural de la célula. Los DARPins constan de al menos tres motivos repetidos o módulos, de los cuales la mayoría de los módulos N- y la mayoría de los C-terminales se denominan "tapas", ya que protegen el núcleo hidrófobo de la proteína. El número de módulos internos se indica como número (por ejemplo, N1C, N2C, N3C, ...) mientras que las tapas se indican con "N" o "C", respectivamente. La masa molecular de, por ejemplo, 14 o 18 kDa ( kilodaltons ) para cuatro (N2C) o cinco (N3C) repeticiones de DARPins es bastante pequeña para un biológico (aproximadamente el 10% del tamaño de una IgG ).
Las DARPins constituyen una nueva clase de terapias de proteínas pequeñas potentes, específicas y versátiles, y se utilizan como herramientas de investigación en diversas aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas . [1] Molecular Partners AG , una compañía biofarmacéutica en etapa clínica con varias moléculas de DARPin en desarrollo clínico y preclínico, está actualmente persiguiendo el desarrollo propio de DARPins terapéuticos ( integración directa ). Athebio AG se basa en la mejora adicional del andamio DARPin para un enfoque de modelo de asociación . [2]
Además, las DARPins se pueden usar como chaperonas de cristalización para proteínas solubles y de membrana, incluidos los receptores acoplados a proteína G (GPCR), ya sea como compañeros de unión o como fusiones rígidas a la proteína diana. [3] [4]
Origen, estructura y generación
La plataforma DARPin fue descubierta y desarrollada en el laboratorio de Andreas Plückthun en la Universidad de Zurich , Suiza , mientras estudiaba ingeniería y bibliotecas de anticuerpos recombinantes. [5] Las DARPins se derivan de proteínas anquirinas naturales, una clase de proteínas que media las interacciones proteína-proteína de alta afinidad en la naturaleza.
Las bibliotecas de DARPin se diseñaron mediante alineamientos de secuencia de varios miles de motivos de repetición de anquirina natural (de aproximadamente 33 aminoácidos cada uno) combinados con un diseño basado en la estructura y métodos de ADN recombinante . [5] Estas proteínas consisten en unidades estructurales repetitivas que forman un dominio proteico estable con una gran superficie de interacción potencial con el objetivo. Típicamente, las DARPins comprenden cuatro o cinco repeticiones, de las cuales la primera (repetición de protección N) y la última (repetición de protección C) sirven para proteger el núcleo de la proteína hidrófoba del entorno acuoso. Las DARPins corresponden al tamaño medio de los dominios proteicos de repetición de anquirina natural. Las proteínas con menos de tres repeticiones (es decir, las repeticiones de protección y una repetición interna) no forman una estructura terciaria suficientemente estable . [6] La masa molecular de un DARPin depende del número total de repeticiones, como se muestra en la siguiente tabla:
Repite | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ... |
---|---|---|---|---|---|---|
Masa aproximada (kDa) | 10 | 14 | 18 | 22 | 26 | ... |
Se han generado bibliotecas de DARPins con residuos de interacción de diana potenciales aleatorizados, con diversidades de más de 10 12 variantes, a nivel de ADN. A partir de estas bibliotecas, los bioquímicos pueden seleccionar DARPins para unirse a la diana de elección con afinidad picomolar y la especificidad puede seleccionarse usando la presentación de ribosomas [7] o la presentación de fagos [8] usando secuencias de señales que permitan la secreción cotraduccional. [9] Las DARPins pueden diseñarse para actuar como agonistas de receptores , antagonistas , agonistas inversos , inhibidores de enzimas o quelantes de proteínas diana simples. [1]
Propiedades y beneficios potenciales de DARPins
Las DARPins se expresan en el citoplasma de Escherichia coli a niveles elevados (más de 10 g / l en fermentación, 1 g / l en matraz de agitación) en forma soluble . [10] Las proteínas exhiben una alta estabilidad térmica y termodinámica ( punto medio de desnaturalización : generalmente desarrollo de equilibrio : ∆G> 9,5 kcal / mol ) que aumenta con el aumento del número de repeticiones. [5] [11] [12] DARPins son estables en humano suero de la sangre y pueden ser diseñados a fin de no contener de células T epítopos .
Debido a la alta especificidad, estabilidad, potencia y afinidad, así como a su arquitectura flexible, las DARPins tienen un modo rígido de unión al cuerpo . [1] [7] Las construcciones multi-específicas o multivalentes hechas por fusión genética sugieren que las DARPins fusionadas tienen propiedades de unión similares a las DARPins de dominio único. [1] La ausencia de cisteínas en el andamio permite la ingeniería de cisteínas específicas del sitio, lo que permite el acoplamiento dirigido al sitio de sustancias químicas a la molécula. Se pueden introducir aminoácidos no naturales con el mismo propósito. [13]
Potencialmente, las DARPins pueden proporcionar un beneficio clínico al superar las limitaciones de los enfoques terapéuticos convencionales, que normalmente se dirigen a una única vía de enfermedad y, por lo tanto, pueden comprometer la eficacia. En muchos casos, la complejidad de una enfermedad resulta de la desregulación de múltiples vías. La tecnología DARPin se puede aprovechar para generar rápidamente miles de "multi-DARPins" diferentes donde los dominios de unión están conectados (es decir, mediante enlazadores), lo que permite la orientación de varias vías de enfermedad. DARPins y multi-DARPins también se pueden fusionar con elementos que no son DARPin, como una toxina, [14] para generar terapias dirigidas, y su fabricación se ve facilitada por la resistencia de DARPins contra la agregación. La diversidad de formatos y la solidez de las DARPins múltiples facilita un enfoque empírico (por ejemplo, a través de la detección basada en resultados) para identificar de manera eficiente las DARPins con actividad potencial en vías de enfermedades específicas.
Los beneficios potenciales de las DARPins se deben en gran parte a sus características estructurales y biofísicas. Se cree que su pequeño tamaño (14-18 kDa) permite una mayor penetración en los tejidos, y su alta potencia (<5-100 pM) hace que las DARPins sean activas a bajas concentraciones. [15] Las DARPins son solubles a> 100 g / L, y su alta estabilidad y solubilidad se consideran propiedades deseables para los compuestos farmacológicos. Las DARPins se pueden producir de forma rápida y rentable (es decir, a partir de E. coli ). Sus propiedades farmacocinéticas (PK) se pueden ajustar mediante la fusión a moléculas que prolongan la vida media, como el polietilenglicol (PEG), o las DARPins que se unen a la seroalbúmina humana. Debido a sus propiedades biofísicas favorables, [1] las DARPins se consideran altamente desarrollables utilizando procesos estándar, exhibiendo potencialmente un comportamiento de clase robusto.
Aplicaciones y desarrollo clínico
Las DARPins se han utilizado como herramientas de investigación, [1] como agentes de diagnóstico [15] y como agentes terapéuticos. [16] [17] [18] [19] MP0112, el primer candidato a DARPin en la clínica, es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y entró en ensayos clínicos para el tratamiento de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (DMAE húmeda, también conocida como degeneración macular neovascular relacionada con la edad) [14] y edema macular diabético [20] a principios de 2010.
Actualmente, MP0112 se está investigando en tres ensayos clínicos diferentes. Los dos primeros ensayos son estudios de seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con DMAE húmeda para establecer la comparabilidad entre pacientes japoneses y no japoneses. [16] [18] El tercer estudio tiene como objetivo probar la seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con EMD. [17]
En julio de 2014, Molecular Partners inició un primer estudio en humanos para investigar la seguridad, la tolerabilidad y los niveles en sangre de MP0250, un segundo candidato a DARPin, en pacientes con cáncer. [19]
Molecular Partners AG tiene varias DARPins adicionales en desarrollo preclínico con posibles indicaciones en diversas áreas de enfermedades, incluida la oftalmología , oncología , inmuno-oncología e inmunología .
Referencias
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