Construcción de ADN
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Una construcción de ADN es un segmento de ADN diseñado artificialmente que se encuentra en un vector y que se puede utilizar para incorporar material genético en un tejido o célula diana . [1] Estos elementos pueden ser tan pequeños como unos pocos miles de pares de bases (kpb) de ADN que lleva un solo gen, o tan grandes como cientos de kbp para estudios genómicos a gran escala. Una construcción de ADN contiene un inserto de ADN , llamado transgén., suministrado a través de un vector de transformación que permite que la secuencia del inserto se replique y / o exprese en la célula diana. Una construcción de ADN puede expresar proteína de tipo salvaje, prevenir la expresión de ciertos genes expresando competidores o inhibidores, o expresar proteínas mutantes, tales como mutaciones por deleción o mutaciones sin sentido . También puede prevenir la expresión de ciertos genes codificando secuencias de competidores o inhibidores de proteínas. Las construcciones de ADN están ampliamente adaptadas en la investigación de biología molecular para técnicas como secuenciación de ADN, expresión de proteínas y estudios de ARN. Una forma en que se pueden crear las construcciones de ADN es modificando las secuencias naturales con la reacción en cadena de la polimerasa; las modificaciones deseadas se incluyen en los cebadores y luego se copian en cada ciclo de replicación. [2]

Normalmente, los vectores usados ​​en las construcciones de ADN contienen un origen de replicación , un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable . [2] Ciertos vectores pueden llevar elementos reguladores adicionales basados ​​en el sistema de expresión involucrado.

Historia

El primer vector estandarizado, pBR220, fue diseñado en 1977 por investigadores del laboratorio de Herbert Boyer. El plásmido contiene varios sitios de enzimas de restricción y un gen estable de resistencia a antibióticos libre de actividades de transposones. [3]

En 1982, Jeffrey Vieira y Joachim Messing describieron el desarrollo de vectores pUC derivados de M13mp7 que consisten en un sitio de clonación múltiple y permiten una secuenciación y clonación más eficiente utilizando un conjunto de cebadores M13 universales. Tres años más tarde, los mismos científicos diseñaron el plásmido pUC19 actualmente popular. [4]

Modos de entrega

Hay tres categorías generales de entrega de construcciones de ADN: física, química y viral. [5] Los métodos físicos, que entregan el ADN al penetrar físicamente en la célula, incluyen microinyección , electroporación y biolística . [6] Los métodos químicos se basan en reacciones químicas para entregar el ADN e incluyen la transformación con células que se vuelven competentes mediante el uso de fosfato de calcio, así como la administración a través de nanopartículas lipídicas. [7] [8] Los métodos virales utilizan una variedad de vectores virales para administrar el ADN, incluidos adenovirus , lentivirus y virus del herpes simple [9]

Tipos de construcciones de ADN

Un vector plasmídico de uso común, pET28a [10]
  • Cromosomas artificiales : se utilizan comúnmente en estudios de proyectos de genoma debido a su capacidad para contener inserciones de hasta 350 kbp. Estos vectores se derivan del plásmido F , aprovechando la alta estabilidad y capacidad de conjugación introducida por el factor F. [11]
  • Los vectores de bacteriófago son inserciones transportadas por el genoma del bacteriófago λ que pueden acomodar hasta 12 kpb sin romper la envoltura del fago. Estos vectores permiten una clonación eficaz ya que el fago puede replicarse dentro de E. coli .
  • Los fosmidos son un híbrido entre los plásmidos F bacterianos y las técnicas de clonación del fago λ. Los insertos se empaquetan previamente en partículas de fagos, luego se insertan en la célula huésped con la capacidad de contener ~ 45 kpb. Normalmente se utilizan para generar una biblioteca de ADN debido a su mayor estabilidad. [12]
  • Los plásmidos bacterianos son vectores capaces de contener inserciones de hasta aproximadamente 20 kpb de longitud. Estos tipos de construcciones contienen típicamente un gen que ofrece resistencia a los antibióticos, un origen de replicación, elementos reguladores como los inhibidores de Lac , un policonector y una etiqueta de proteína que facilita la purificación de la proteína. [13]

Ver también

  • Construcciones de rescate
  • Constructo de disrupción
  • Vector (biología molecular)

Referencias

  1. ^ Pinkert, Carl (2014). Tecnología de animales transgénicos: un manual de laboratorio . Amsterdam: Elsevier. pag. 692. ISBN 9780124095366.
  2. ^ a b Carter, Matt; Shieh, Jennifer C. (2010), "Clonación molecular y tecnología de ADN recombinante" , Guía de técnicas de investigación en neurociencia , Elsevier, págs. 207–227, doi : 10.1016 / b978-0-12-374849-2.00009-4 , ISBN 978-0-12-374849-2, consultado el 2020-10-24
  3. ^ Bolívar, Francisco; Rodríguez, Raymond L .; Betlach, Mary C .; Boyer, Herbert W. (1 de noviembre de 1977). "Construcción y caracterización de nuevos vehículos de clonación I. Derivados resistentes a ampicilina del plásmido pMB9" . Gene . 2 (2): 75–93. doi : 10.1016 / 0378-1119 (77) 90074-9 . ISSN 0378-1119 . PMID 344136 .  
  4. ^ Yanisch-Perron, Celeste; Vieira, Jeffrey; Messing, Joachim (1 de enero de 1985). "Vectores mejorados de clonación de fagos M13 y cepas hospedadoras: secuencias de nucleótidos de los vectores M13mpl8 y pUC19" . Gene . 33 (1): 103-119. doi : 10.1016 / 0378-1119 (85) 90120-9 . ISSN 0378-1119 . PMID 2985470 .  
  5. ^ Carter, Matt; Shieh, Jennifer C. (2010), "Gene Delivery Strategies" , Guide to Research Techniques in Neuroscience , Elsevier, págs. 229–242, doi : 10.1016 / b978-0-12-374849-2.00010-0 , ISBN 978-0-12-374849-2, consultado el 2020-10-24
  6. ^ Mehierhumbert, S; Guy, R (5 de abril de 2005). "Métodos físicos para la transferencia de genes: mejora de la cinética de la entrega de genes en las células" . Revisiones avanzadas de entrega de medicamentos . 57 (5): 733–753. doi : 10.1016 / j.addr.2004.12.007 . PMID 15757758 . 
  7. ^ Felgner, PL; Gadek, TR; Holm, M .; Roman, R .; Chan, HW; Wenz, M .; Northrop, JP; Ringold, GM; Danielsen, M. (1 de noviembre de 1987). "Lipofección: un procedimiento de transfección de ADN mediada por lípidos altamente eficaz" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 84 (21): 7413–7417. doi : 10.1073 / pnas.84.21.7413 . ISSN 0027-8424 . PMC 299306 . PMID 2823261 .   
  8. ^ Kingston, Robert E .; Chen, Claudia A .; Rose, John K. (2003). "Transfección de fosfato de calcio" . Protocolos actuales en biología molecular . 63 (1): 9.1.1–9.1.11. doi : 10.1002 / 0471142727.mb0901s63 . ISSN 1934-3647 . PMID 18265332 . S2CID 46188175 .   
  9. ^ Robbins, Paul D .; Ghivizzani, Steven C. (1998). "Vectores virales para terapia génica" . Farmacología y terapéutica . 80 (1): 35–47. doi : 10.1016 / S0163-7258 (98) 00020-5 . PMID 9804053 . 
  10. ^ Shen, Aimee; Lupardus, Patrick J .; Morell, Montse; Ponder, Elizabeth L .; Sadaghiani, A. Masoud; García, K. Christopher; Bogyo, Matthew (2 de diciembre de 2009). Xu, Wenqing (ed.). "Purificación de proteínas mejorada y simplificada utilizando una etiqueta enzimática de autoprocesamiento inducible" . PLOS ONE . 4 (12): e8119. doi : 10.1371 / journal.pone.0008119 . ISSN 1932-6203 . PMC 2780291 . PMID 19956581 .   
  11. ^ Godiska, R .; Wu, C.-C .; Mead, DA (01/01/2013), "Genomic Libraries" , en Maloy, Stanley; Hughes, Kelly (eds.), Enciclopedia de genética de Brenner (segunda edición) , San Diego: Academic Press, págs. 306–309, doi : 10.1016 / b978-0-12-374984-0.00641-0 , ISBN 978-0-08-096156-9, consultado el 6 de noviembre de 2020
  12. ^ Hu, Bo; Khara, Pratick; Christie, Peter J. (9 de julio de 2019). "Bases estructurales para la conjugación del plásmido F y biogénesis de pilus F en Escherichia coli" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 116 (28): 14222-14227. doi : 10.1073 / pnas.1904428116 . ISSN 0027-8424 . PMC 6628675 . PMID 31239340 .   
  13. ^ Griffiths, Anthony JF (2015). Introducción al análisis genético . Nueva York: WH Freeman & Company. ISBN 978-1464188046.
  • v
  • t
  • mi
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