Electroforesis en gel de ácidos nucleicos
La electroforesis de ácidos nucleicos es una técnica analítica que se utiliza para separar fragmentos de ADN o ARN por tamaño y reactividad. Las moléculas de ácido nucleico que se van a analizar se colocan en un medio viscoso, el gel , donde un campo eléctrico induce a los ácidos nucleicos (que están cargados negativamente debido a su estructura de azúcar- fosfato ) a migrar hacia el ánodo (que está cargado positivamente porque esta es una celda electrolítica en lugar de galvánica). La separación de estos fragmentos se logra aprovechando las movilidades con las que moléculas de diferentes tamaños pueden atravesar el gel. Las moléculas más largas migran más lentamente porque experimentan más resistencia dentro del gel. Debido a que el tamaño de la molécula afecta su movilidad, los fragmentos más pequeños terminan más cerca del ánodo que los más largos en un período determinado. Después de algún tiempo, se elimina el voltaje y se analiza el gradiente de fragmentación. Para separaciones más grandes entre fragmentos de tamaño similar, se puede aumentar el voltaje o el tiempo de ejecución. Los recorridos prolongados a través de un gel de bajo voltaje producen la resolución más precisa. Sin embargo, el voltaje no es el único factor para determinar la electroforesis de ácidos nucleicos.
El ácido nucleico a separar se puede preparar de varias formas antes de la separación por electroforesis. En el caso de moléculas de ADN grandes, el ADN se corta con frecuencia en fragmentos más pequeños utilizando una endonucleasa de restricción de ADN (o enzima de restricción). En otros casos, como las muestras amplificadas por PCR , las enzimas presentes en la muestra que podrían afectar la separación de las moléculas se eliminan por diversos medios antes del análisis. Una vez que el ácido nucleico está preparado correctamente, las muestras de la solución de ácido nucleico se colocan en los pocillos del gel y se aplica un voltaje a través del gel durante un período de tiempo específico.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se visualizan utilizando un colorante fluorescente específico para el ADN, como el bromuro de etidio . El gel muestra bandas correspondientes a diferentes poblaciones de moléculas de ácido nucleico con diferente peso molecular. El tamaño de los fragmentos se informa habitualmente en "nucleótidos", "pares de bases" o "kb" (para miles de pares de bases) dependiendo de si se ha separado el ácido nucleico monocatenario o bicatenario. La determinación del tamaño de los fragmentos se realiza típicamente por comparación con marcadores de ADN disponibles comercialmente que contienen fragmentos de ADN lineales de longitud conocida.
Los tipos de gel más comúnmente utilizados para la electroforesis de ácidos nucleicos son agarosa (para moléculas de ADN relativamente largas) y poliacrilamida (para alta resolución de moléculas de ADN cortas, por ejemplo, en secuenciación de ADN ). Los geles se han procesado convencionalmente en un formato de "placa" como el que se muestra en la figura, pero la electroforesis capilar se ha vuelto importante para aplicaciones como la secuenciación de ADN de alto rendimiento. Las técnicas de electroforesis utilizadas en la evaluación del daño del ADN incluyen la electroforesis en gel alcalino y la electroforesis en gel de campo pulsado .
Para segmentos de ADN cortos, como ADN de doble hebra de 20 a 60 pb, ejecutarlos en gel de poliacrilamida (PAGE) dará una mejor resolución (condición nativa). [1] De manera similar, el ARN y el ADN monocatenario pueden analizarse y visualizarse mediante geles PAGE que contienen agentes desnaturalizantes como la urea. Los geles PAGE se utilizan ampliamente en técnicas como la impresión de pie de ADN, EMSA y otras técnicas de interacción ADN-proteína.
La medición y el análisis se realizan principalmente con un software de análisis de gel especializado. Los resultados de la electroforesis capilar generalmente se muestran en una vista de trazas llamada electroferograma .
