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El carril 1 es un control negativo y solo contiene material genético. El carril 2 contiene proteínas y un fragmento de ADN que, según su secuencia, no interactúa. El carril 3 contiene proteína y un fragmento de ADN que reacciona; el complejo resultante es más grande, más pesado y de movimiento más lento. El patrón que se muestra en el carril 3 es el que resultaría si todo el ADN estuviera unido y no se produjera disociación del complejo durante la electroforesis. Cuando no se cumplen estas condiciones, se puede ver una segunda banda en el carril 3 que refleja la presencia de ADN libre o la disociación del complejo ADN-proteína.

Un ensayo de movilidad electroforética cambio (EMSA) o electroforesis de cambio de movilidad , también conocido como un ensayo de desplazamiento en gel , ensayo de cambio de movilidad en gel , ensayo de desplazamiento de banda , o ensayo de retardo en gel , es un común electroforesis afinidad técnica utilizada para estudio proteína-ADN o proteína - Interacciones de ARN . Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia de ADN o ARN determinada y, a veces, puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de desplazamiento de gel a menudo se realizan in vitro.simultáneamente con la huella de ADNasa , la extensión del cebador y los experimentos de promotor-sonda al estudiar el inicio de la transcripción , la replicación de la banda de ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y la maduración del ARN, así como el empalme de pre-ARNm. [1] Aunque se pueden encontrar precursores en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin [2] y Fried y Crothers . [3]

Principio [ editar ]

Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un período corto (alrededor de 1,5 a 2 horas para un gel de 15 a 20 cm). [4] La velocidad a la que las diferentes moléculas (y combinaciones de las mismas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga y, en menor medida, por su forma (ver electroforesis en gel). El carril de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una única banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, asumiendo que la proteína es capaz de unirse al fragmento, el carril con una proteína que se une contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de la sonda de ácido nucleico unida a la proteína que está 'desplazada' hacia arriba en el gel. (ya que se ha movido más lentamente).

En las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido y no unido en el gel refleja la fracción de moléculas sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión entra en el gel. Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de enjaulamiento", en el que la proteína, rodeada por la matriz de gel, no puede difundirse fuera de la sonda antes de que se recombinen. [5] Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. [6]A menos que el complejo tenga una vida muy larga en condiciones de gel, o se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número derivado es un Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína pero sí la estequiometría compleja, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de la sonda de ADN hasta que los incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. En comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre ejecutadas en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína. [4]

Variantes y adiciones [ editar ]

Se puede agregar un anticuerpo que reconoce la proteína a esta mezcla para crear un complejo aún más grande con un cambio mayor. Este método se denomina ensayo de superdesplazamiento y se utiliza para identificar de forma inequívoca una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.

A menudo, se ejecuta un carril adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite la identificación del sitio de unión preciso por competencia (no se muestra en el diagrama). Las variantes del ensayo de competición son útiles para medir la especificidad de la unión y para medir la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también podría usarse como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unen a una proteína determinada. [ cita requerida ]

Una vez que se determina in vitro la unión ADN-proteína , varios algoritmos pueden limitar la búsqueda de identificación del factor de transcripción. Los oligonucleótidos de secuencia de consenso para el factor de transcripción de interés podrán competir por la unión, eliminando la banda desplazada, y deben ser confirmados por superdesplazamiento. Si la secuencia de consenso predicha no compite por la unión, la identificación del factor de transcripción puede ser ayudada por el competidor multiplexado EMSA (MC-EMSA), mediante el cual se multiplexan grandes conjuntos de secuencias de consenso en cada reacción, y cuando un conjunto compite por la unión, el Las secuencias de consenso individuales de este conjunto se procesan en una reacción adicional. [7]

Para fines de visualización, el fragmento de ácido nucleico normalmente se marca con un marcador radiactivo , fluorescente o biotina . La tinción estándar con bromuro de etidio es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad para detectar el ácido nucleico si se utilizan pequeñas cantidades de ácido nucleico o ácido nucleico monocatenario en estos experimentos. Cuando se usa un marcador de biotina, se usa estreptavidina conjugada con una enzima como la peroxidasa de rábano picante para detectar el fragmento de ADN. [8] [9]Si bien el marcaje de ADN isotópico tiene poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión a proteínas, el uso de marcadores no isotópicos que incluyen fluoróforos o biotina puede alterar la afinidad y / o la estequiometría de la interacción proteica de interés. La competencia entre la sonda marcada con fluoróforo o biotina y el ADN sin marcar de la misma secuencia puede usarse para determinar si el marcador altera la afinidad de unión o la estequiometría.

Referencias [ editar ]

  1. ^ Granadino B, Penalva LO, Green MR, Valcarcel J, Sanchez L. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7343-8.
  2. ^ Garner MM, Revzin A (julio de 1981). "Un método de electroforesis en gel para cuantificar la unión de proteínas a regiones específicas de ADN: aplicación a componentes del sistema regulador del operón lactosa de Escherichia coli" . Ácidos nucleicos Res . 9 (13): 3047–60. doi : 10.1093 / nar / 9.13.3047 . PMC  327330 . PMID  6269071 .
  3. ^ Fried M, Crothers DM (diciembre de 1981). "Equilibrios y cinética de interacciones represor-operador lac por electroforesis en gel de poliacrilamida" . Ácidos nucleicos Res . 9 (23): 6505-25. doi : 10.1093 / nar / 9.23.6505 . PMC 327619 . PMID 6275366 .  
  4. ↑ a b Ausubel, Frederick M. (1994). Protocolos actuales en biología molecular . Chichester: John Wiley & Sons. págs. 12.2.1-11. ISBN 0-471-50337-1.
  5. ^ Fried MG, Liu G (1994). "El secuestro molecular estabiliza los complejos CAP-ADN durante la electroforesis en gel de poliacrilamida" . Investigación de ácidos nucleicos . 22 (23): 5054–5059. doi : 10.1093 / nar / 22.23.5054 . PMC 523777 . PMID 7800499 .  
  6. ^ Fried MG (1989). "Medición de los parámetros de interacción proteína-ADN mediante ensayo de cambio de movilidad de electroforesis". Electroforesis . 10 (5–6): 366–376. doi : 10.1002 / elps.1150100515 . PMID 2670548 . S2CID 19372331 .  
  7. ^ Smith AJ, Humphries SE (enero de 2009). "Caracterización de proteínas de unión a ADN utilizando competidor multiplexado EMSA". J. Mol. Biol . 385 (3): 714–7. doi : 10.1016 / j.jmb.2008.11.035 . PMID 19059416 . 
  8. ^ Hellman, Lance M; Fried, Michael G (2007). "Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) para detectar interacciones proteína-ácido nucleico" . Protocolos de la naturaleza . 2 (8): 1849–1861. doi : 10.1038 / nprot.2007.249 . ISSN 1754-2189 . PMC 2757439 . PMID 17703195 .   
  9. ^ Osmosensing y Osmosignaling . Prensa académica. 1 de octubre de 2007. págs. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.

Enlaces externos [ editar ]

  • Protocolo de cambio de gel quimioluminiscente