Termodinámica de ácidos nucleicos

La termodinámica de ácidos nucleicos es el estudio de cómo la temperatura afecta la estructura de ácidos nucleicos del ADN de doble hebra (dsDNA). La temperatura de fusión ( T _m ) se define como la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN están en la espiral al azar o estado de cadena sencilla (ssDNA). T _m depende de la longitud de la molécula de ADN y de su secuencia de nucleótidos específica . El ADN, cuando se encuentra en un estado en el que sus dos hebras están disociadas (es decir, la molécula de dsDNA existe como dos hebras independientes), se denomina desnaturalizado por la alta temperatura.

Conceptos

Hibridación

Artículo principal: Hibridación (biología molecular)

La hibridación es el proceso de establecer una interacción específica de secuencia no covalente entre dos o más hebras complementarias de ácidos nucleicos en un solo complejo, que en el caso de dos hebras se denomina dúplex . Los oligonucleótidos , el ADN o el ARN se unirán a su complemento en condiciones normales, por lo que dos hebras perfectamente complementarias se unirán entre sí fácilmente. Para reducir la diversidad y obtener los complejos más energéticamente preferidos, una técnica llamada recocidose utiliza en la práctica de laboratorio. Sin embargo, debido a las diferentes geometrías moleculares de los nucleótidos, una sola inconsistencia entre las dos cadenas hará que la unión entre ellas sea menos favorable desde el punto de vista energético. La medición de los efectos de la incompatibilidad de bases cuantificando la temperatura a la que se hibridan dos hebras puede proporcionar información sobre la similitud en la secuencia de bases entre las dos hebras que se hibridan. Los complejos pueden disociarse mediante desnaturalización térmica , también denominada fusión. En ausencia de factores externos negativos, los procesos de hibridación y fusión pueden repetirse en sucesión indefinidamente, lo que sienta las bases para la reacción en cadena de la polimerasa . Más comúnmente, se forman los pares de bases nucleicas A = T y G≡C, de las cuales esta última es más estable.

Desnaturalización

La desnaturalización del ADN, también llamada fusión del ADN, es el proceso mediante el cual el ácido desoxirribonucleico de doble hebra se desenrolla y se separa en hebras de una sola hebra mediante la ruptura de las atracciones de apilamiento hidrófobo entre las bases. Ver efecto hidrofóbico . Ambos términos se utilizan para referirse al proceso tal como ocurre cuando se calienta una mezcla, aunque "desnaturalización" también puede referirse a la separación de hebras de ADN inducida por productos químicos como formamida o urea . ^[1]

El proceso de desnaturalización del ADN se puede utilizar para analizar algunos aspectos del ADN. Debido a que el emparejamiento de bases de citosina / guanina es generalmente más fuerte que el emparejamiento de bases de adenina / timina, la cantidad de citosina y guanina en un genoma (llamado " contenido de GC ") se puede estimar midiendo la temperatura a la que se funde el ADN genómico. ^[2] Las temperaturas más altas están asociadas con un alto contenido de GC.

La desnaturalización del ADN también se puede usar para detectar diferencias de secuencia entre dos secuencias de ADN diferentes. El ADN se calienta y desnaturaliza a un estado monocatenario y la mezcla se enfría para permitir que las cadenas se vuelvan a hibridar. Las moléculas híbridas se forman entre secuencias similares y cualquier diferencia entre esas secuencias dará como resultado una interrupción del emparejamiento de bases. A escala genómica, los investigadores han utilizado el método para estimar la distancia genética entre dos especies, un proceso conocido como hibridación ADN-ADN . ^[3] En el contexto de una sola región aislada de ADN, se pueden usar geles de gradiente desnaturalizante y geles de gradiente de temperatura para detectar la presencia de pequeños desajustes entre dos secuencias, un proceso conocido comoelectroforesis en gel de gradiente de temperatura . ^{[4] [5]}

Los métodos de análisis de ADN basados ​​en la temperatura de fusión tienen la desventaja de ser sustitutos del estudio de la secuencia subyacente; La secuenciación de ADN generalmente se considera un método más preciso.

El proceso de fusión del ADN también se utiliza en técnicas de biología molecular, especialmente en la reacción en cadena de la polimerasa . Aunque la temperatura de fusión del ADN no es diagnóstica en la técnica, los métodos para estimar T _m son importantes para determinar las temperaturas apropiadas para usar en un protocolo. Las temperaturas de fusión del ADN también se pueden usar como proxy para igualar las fuerzas de hibridación de un conjunto de moléculas, por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos de microarreglos de ADN .

Recocido

Para otros usos, consulte Recocido (desambiguación) .

El recocido, en genética , significa que las secuencias complementarias de ADN o ARN monocatenario se emparejen mediante enlaces de hidrógeno para formar un polinucleótido bicatenario . Antes de que pueda ocurrir el recocido, es posible que una de las hebras deba ser fosforilada por una enzima como la quinasa para permitir que se produzca un enlace de hidrógeno adecuado. El término hibridación se usa a menudo para describir la unión de una sonda de ADN o la unión de un cebador a una cadena de ADN durante una reacción en cadena de la polimerasa . El término también se utiliza a menudo para describir la reforma ( renaturalización) de hebras complementarias inversas que fueron separadas por calor (desnaturalizadas térmicamente). Las proteínas como RAD52 pueden ayudar a templar el ADN. La hibridación de cadenas de ADN es un paso clave en las vías de recombinación homóloga . En particular, durante la meiosis , la hibridación de cadenas dependiente de la síntesis es una vía principal de recombinación homóloga.

Apilado

Estabilidad de fusión de las pilas de pares de bases (ADN B) ^[6]

Paso	Fusión ΔG ° 37 (Kcal / mol)
ejército de reserva	-0,12
TG o CA	-0,78
CG	-1,44
AG o CT	-1,29
AA o TT	-1.04
A	-1,27
GA o TC	-1,66
CC o GG	-1,97
AC o GT	-2.04
GC	-2,70

El apilamiento es la interacción estabilizadora entre las superficies planas de bases adyacentes. El apilamiento puede ocurrir con cualquier cara de la base, es decir, 5'-5 ', 3'-3' y viceversa. ^[7]

El apilamiento en moléculas de ácido nucleico "libres" se debe principalmente a la fuerza intermolecular , específicamente la atracción electrostática entre anillos aromáticos, un proceso también conocido como apilamiento pi . Para sistemas biológicos con agua como disolvente, el efecto hidrofóbico contribuye y ayuda a la formación de una hélice. ^{[8] El} apilamiento es el principal factor estabilizador en la doble hélice del ADN. ^[9]

La contribución del apilamiento a la energía libre de la molécula se puede estimar experimentalmente observando el equilibrio de apilamiento doblado en el ADN mellado . Tal estabilización depende de la secuencia. ^[6] El grado de estabilización varía con las concentraciones de sal y la temperatura. ^[9]

Termodinámica del modelo de dos estados

Se utilizan varias fórmulas para calcular los valores de T _m . ^{[10] [11]} Algunas fórmulas son más precisas para predecir las temperaturas de fusión de los dúplex de ADN. ^[12] Para los oligonucleótidos de ADN, es decir, secuencias cortas de ADN, la termodinámica de la hibridación puede describirse con precisión como un proceso de dos estados. En esta aproximación se desprecia la posibilidad de estados intermedios de unión parcial en la formación de un estado bicatenario a partir de dos oligonucleótidos monocatenarios. Bajo esta suposición, se pueden describir elegantemente los parámetros termodinámicos para formar el ácido nucleico bicatenario AB a partir de los ácidos nucleicos monocatenarios A y B.

AB ↔ A + B

La constante de equilibrio para esta reacción es . Según la ecuación de Van´t Hoff, la relación entre la energía libre, Δ G y K es Δ G ° = - RT ln K , donde R es la constante de la ley de los gases ideales y T es la temperatura kelvin de la reacción. Esto da, para el sistema de ácido nucleico,${\displaystyle K={\frac {[A][B]}{[AB]}}}$

${\displaystyle \Delta G^{\circ }=-RT\ln {\frac {[A][B]}{[AB]}}}$.

La temperatura de fusión, T _m , ocurre cuando la mitad del ácido nucleico bicatenario se ha disociado. Si no hay presentes ácidos nucleicos adicionales, entonces [A], [B] y [AB] serán iguales e iguales a la mitad de la concentración inicial de ácido nucleico bicatenario, [AB] _inicial . Esto da una expresión para el punto de fusión de un dúplex de ácido nucleico de

${\displaystyle T_{m}=-{\frac {\Delta G^{\circ }}{R\ln {\frac {[AB]_{initial}}{2}}}}}$.

Como Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T _m también está dada por

${\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }-R\ln {\frac {[AB]_{initial}}{2}}}}}$.

Los términos Δ H ° y Δ S ° generalmente se dan para la asociación y no para la reacción de disociación (ver el método del vecino más cercano, por ejemplo). Esta fórmula luego se convierte en: ^[13]

${\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }+R\ln([A]_{total}-[B]_{total}/2)}}}$, donde [B] _total <[A] _total .

Como se mencionó, esta ecuación se basa en la suposición de que solo dos estados están involucrados en la fusión: el estado bicatenario y el estado de bobina aleatoria. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden fundirse a través de varios estados intermedios. Para dar cuenta de un comportamiento tan complicado, se deben utilizar los métodos de la mecánica estadística , lo que es especialmente relevante para secuencias largas.

Estimación de propiedades termodinámicas a partir de la secuencia de ácidos nucleicos.

El párrafo anterior muestra cómo la temperatura de fusión y los parámetros termodinámicos (Δ G ° o Δ H ° y Δ S °) se relacionan entre sí. A partir de la observación de las temperaturas de fusión, se pueden determinar experimentalmente los parámetros termodinámicos. Viceversa, e importante para las aplicaciones, cuando se conocen los parámetros termodinámicos de una secuencia de ácido nucleico dada, se puede predecir la temperatura de fusión. Resulta que para los oligonucleótidos, estos parámetros pueden aproximarse bien mediante el modelo del vecino más cercano.

Método del vecino más cercano

La interacción entre bases en diferentes hebras depende de alguna manera de las bases vecinas. En lugar de tratar una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases, el modelo de vecino más cercano trata una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases "vecinos". ^[13] Entonces, por ejemplo, el ADN que se muestra a continuación tiene interacciones con el vecino más cercano indicadas por las flechas.

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

5 'CGTTGA 3'

3 'GCAACT 5'

La energía libre de formar este ADN a partir de las hebras individuales, Δ G °, se representa (a 37 ° C) como

Δ G ° ₃₇ (previsto) = Δ G ° ₃₇ (inicio C / G) + Δ G ° ₃₇ (CG / GC) + Δ G ° ₃₇ (GT / CA) + Δ G ° ₃₇ (TT / AA) + Δ G ° ₃₇ (TG / AC) + Δ G ° ₃₇ (GA / CT) + Δ G ° ₃₇ (inicio A / T)

Excepto por el término de iniciación C / G, el primer término representa la energía libre del primer par de bases, CG, en ausencia de un vecino más cercano. El segundo término incluye tanto la energía libre de formación del segundo par de bases, GC, como la interacción de apilamiento entre este par de bases y el par de bases anterior. Los términos restantes se definen de manera similar. En general, la energía libre de formar un dúplex de ácido nucleico es

${\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {initiations} )+\sum _{i=1}^{10}n_{i}\Delta G_{37}^{\circ }(i)}$,

donde representa la energía libre asociada con uno de los diez posibles pares de nucleótidos vecinos más cercanos, y representa su recuento en la secuencia.${\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(i)}$${\displaystyle n_{i}}$

Cada término Δ G ° tiene parámetros entálpicos, Δ H ° y entrópicos, Δ S °, por lo que el cambio en la energía libre también viene dado por

${\displaystyle \Delta G^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta H_{\mathrm {total} }^{\circ }-T\Delta S_{\mathrm {total} }^{\circ }}$.

Se han determinado valores de Δ H ° y Δ S ° para los diez posibles pares de interacciones. Estos se dan en la Tabla 1, junto con el valor de Δ G ° calculado a 37 ° C. Usando estos valores, se calcula que el valor de Δ G ₃₇ ° para el dúplex de ADN que se muestra arriba es -22,4 kJ / mol. El valor experimental es −21,8 kJ / mol.

Tabla 1. Parámetros del vecino más cercano para dúplex de ADN / ADN en NaCl 1 M. ^[13]

Secuencia del vecino más cercano (5'-3 '/ 3'-5')	${\displaystyle \Delta H}$° kJ / mol	${\displaystyle \Delta S}$° J / (mol · K)	${\displaystyle \Delta G}$° 37 kJ / mol
AA / TT	−33,1	−92,9	−4,26
AT / TA	−30,1	−85,4	−3,67
TA / AT	−30,1	−89,1	−2,50
CA / GT	−35,6	−95,0	−6,12
GT / CA	−35,1	−93,7	−6,09
CT / GA	−32,6	−87,9	−5,40
GA / CT	−34,3	−92,9	−5,51
CG / GC	−44,4	−113,8	−9,07
GC / CG	−41,0	−102,1	−9,36
GG / CC	−33,5	−83,3	−7,66
Par de bases de terminal A / T	9,6	17.2	4.31
Par de bases terminales G / C	0.4	−11,7	4.05

Los parámetros asociados con los diez grupos de vecinos que se muestran en la tabla 1 se determinan a partir de los puntos de fusión de los dúplex de oligonucleótidos cortos. Curiosamente, resulta que solo ocho de los diez grupos son independientes.

El modelo de vecino más cercano puede extenderse más allá de los pares de Watson-Crick para incluir parámetros para las interacciones entre los desajustes y los pares de bases vecinos. ^[14] Esto permite la estimación de los parámetros termodinámicos de secuencias que contienen desajustes aislados, como p. Ej. (Flechas que indican desajuste)

          ↓↓↓

5 'GGACTGACG 3'

3 'CCTGGCTGC 5'

Estos parámetros se han ajustado a partir de experimentos de fusión y en la literatura se puede encontrar una extensión de la Tabla 1 que incluye desajustes.

Una forma más realista de modelar el comportamiento de los ácidos nucleicos sería tener parámetros que dependan de los grupos vecinos en ambos lados de un nucleótido, dando una tabla con entradas como "TCG / AGC". Sin embargo, esto involucraría alrededor de 32 grupos para el emparejamiento Watson-Crick e incluso más para las secuencias que contienen desajustes; el número de experimentos de fusión de ADN necesarios para obtener datos fiables para tantos grupos sería inconvenientemente alto. Sin embargo, existen otros medios para acceder a los parámetros termodinámicos de los ácidos nucleicos: la tecnología de microarrays permite el seguimiento de la hibridación de decenas de miles de secuencias en paralelo. Estos datos, en combinación con la teoría de la adsorción molecular, permiten la determinación de muchos parámetros termodinámicos en un solo experimento ^[15] e ir más allá del modelo vecino más cercano.^[16] En general, las predicciones del método del vecino más cercano concuerdan razonablemente bien con los resultados experimentales, pero existen algunas secuencias periféricas inesperadas que exigen más conocimientos. ^[16] Por último, también debemos mencionar la mayor precisión proporcionada por los ensayos de descompresión de una sola molécula que proporcionan una gran cantidad de nuevos conocimientos sobre la termodinámica de la hibridación del ADN y la validez del modelo del vecino más cercano. ^[17]

Ver también

• Punto de fusion
• Primer (biología molecular) para cálculos de T _m
• Base par
• ADN complementario
• Western blot

Referencias

1. Divan, Royds (2013). Herramientas y técnicas en ciencia biomolecular . Prensa de la Universidad de Oxford. pag. 243.
2. M. Mandel; J. Marmur (1968). Uso del perfil de absorbancia ultravioleta-temperatura para determinar el contenido de guanina más citosina del ADN . Métodos en enzimología. 12 . págs.  198–206 . doi : 10.1016 / 0076-6879 (67) 12133-2 . ISBN 978-0-12-181856-2.
3. CG Sibley; JE Ahlquist (1984). "La filogenia de los primates hominoides, como lo indica la hibridación de ADN-ADN". Revista de evolución molecular . 20 (1): 2-15. Código bibliográfico : 1984JMolE..20 .... 2S . doi : 10.1007 / BF02101980 . PMID 6429338 . 
4. RM Myers; T. Maniatis; LS Lerman (1987). Detección y localización de cambios de base única mediante electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante . Métodos en enzimología. 155 . págs.  501–527 . doi : 10.1016 / 0076-6879 (87) 55033-9 . ISBN 978-0-12-182056-5. PMID  3431470 .
5. T. Po; G. Steger; V. Rosenbaum; J. Kaper; D. Riesner (1987). "ARN 5 asociado a cucumovirus bicatenario: análisis experimental de variantes necrógenas y no necrógenas mediante electroforesis en gel de gradiente de temperatura" . Investigación de ácidos nucleicos . 15 (13): 5069–5083. doi : 10.1093 / nar / 15.13.5069 . PMC 305948 . PMID 3601667 .  
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7. "Definición de términos" . Base de datos de ácidos nucleicos . Consultado el 4 de abril de 2019 .
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17. Huguet, JM; Bizarro, CV; Forns, N .; Smith, SB; Bustamante, C .; Ritort, F. (2010). "Derivación de una sola molécula de energías libres de pares de bases dependientes de sal en el ADN" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 107 (35): 15431–6. arXiv : 1010.1188 . Código bibliográfico : 2010PNAS..10715431H . doi : 10.1073 / pnas.1001454107 . PMC 2932562 . PMID 20716688 .  

enlaces externos

Recursos de la biblioteca sobre la hibridación de ácidos nucleicos

Recursos en tu biblioteca Recursos en otras bibliotecas

• T m cálculos en OligoANALYZER - Integrated DNA Technologies
• Cálculos de termodinámica de ADN: T m , perfil de fusión, desajustes, cálculos de energía libre
• Cálculo de T m - por bioPHP.org.
• https://web.archive.org/web/20080516194508/http://www.promega.com/biomath/calc11.htm#disc
• Cálculo de Invitrogen T m
• Software de código abierto AnnHyb para el cálculo de T m utilizando el método del vecino más cercano
• Notas técnicas sigma-aldrich
• Cálculo de Primer3
• "Descubrimiento de la hélice híbrida y la primera hibridación de ADN-ARN" por Alexander Rich
• uMelt: predicción de la curva de fusión
• Herramienta Tm
• Base de datos del vecino más cercano: proporciona una descripción de los parámetros del vecino más cercano de la interacción ARN-ARN y ejemplos de su uso.