La electroforesis en gel en gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante ( DGGE ) son formas de electroforesis que utilizan un gradiente químico o de temperatura para desnaturalizar la muestra a medida que se mueve a través de un gel de acrilamida . TGGE y DGGE se pueden aplicar a ácidos nucleicos como ADN y ARN , y (con menos frecuencia) proteínas. TGGE se basa en cambios de estructura dependientes de la temperatura para separar los ácidos nucleicos . DGGE separa genes del mismo tamaño basándose en su diferente capacidad desnaturalizante que está determinada por su secuencia de pares de bases. DGGE fue la técnica original y TGGE una refinamiento de la misma.
Historia
La DGGE fue inventada por Leonard Lerman , mientras era profesor en SUNY Albany. [1] [2] [3]
El mismo equipo se puede utilizar para el análisis de proteínas , que fue realizado por primera vez por Thomas E. Creighton del Laboratorio de Biología Molecular MRC , Cambridge, Inglaterra. [4] Las proteínas y los ácidos nucleicos producen patrones de apariencia similares, pero los principios fundamentales son bastante diferentes.
TGGE fue descrito por primera vez por Thatcher y Hodson [5] y por Roger Wartell de Georgia Tech. El grupo de Riesner en Alemania realizó un extenso trabajo. El equipo comercial para DGGE está disponible en Bio-Rad, INGENY y CBS Scientific; un sistema para TGGE está disponible en Biometra.
Electroforesis en gel de gradiente de temperatura
El ADN tiene una carga negativa y, por lo tanto, se moverá al electrodo positivo en un campo eléctrico. Un gel es una malla molecular, con agujeros aproximadamente del mismo tamaño que el diámetro de la cadena de ADN. Cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN comenzará a moverse a través del gel, a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional a la longitud de la molécula de ADN (longitudes más cortas de ADN viajan más rápido); esta es la base para la separación dependiente del tamaño en la electroforesis estándar .
En TGGE también hay un gradiente de temperatura a través del gel. A temperatura ambiente, el ADN existirá de forma estable en forma de doble hebra. A medida que aumenta la temperatura, las hebras comienzan a separarse ( derretirse ) y la velocidad a la que se mueven a través del gel disminuye drásticamente. Fundamentalmente, la temperatura a la que se produce la fusión depende de la secuencia (los pares de bases GC son más estables que el AT debido a las interacciones de apilamiento, no debido a la diferencia en los enlaces de hidrógeno [ cita requerida ] (hay tres enlaces de hidrógeno entre un par de bases de citosina y guanina) , pero solo dos entre la adenina y la timina )), por lo que TGGE proporciona un "método dependiente de la secuencia e independiente del tamaño" para separar moléculas de ADN. TGGE separa moléculas y proporciona información adicional sobre el comportamiento de fusión y la estabilidad (Biometra, 2000).
Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando una pequeña muestra de ADN (o ARN) a un gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante . Los investigadores han descubierto que ciertos geles desnaturalizantes son capaces de inducir la fusión del ADN en varias etapas. Como resultado de esta fusión, el ADN se esparce a través del gel y se puede analizar en busca de componentes individuales, incluso aquellos tan pequeños como 200-700 pares de bases .
Lo único de la técnica DGGE es que, a medida que el ADN se somete a condiciones de desnaturalización cada vez más extremas, las hebras fundidas se fragmentan completamente en hebras simples. El proceso de desnaturalización en un gel desnaturalizante es muy agudo: "En lugar de derretirse parcialmente de una manera continua similar a una cremallera, la mayoría de los fragmentos se funden en un proceso escalonado. Porciones discretas o dominios del fragmento de repente se vuelven monocatenarios dentro de una muy estrecha gama de condiciones desnaturalizantes "(Helms, 1990). Esto hace posible discernir diferencias en las secuencias de ADN o mutaciones de varios genes: las diferencias de secuencia en fragmentos de la misma longitud a menudo hacen que se fundan parcialmente en diferentes posiciones en el gradiente y por lo tanto se "detengan" en diferentes posiciones en el gel. Comparando el comportamiento de fusión de los fragmentos de ADN polimórficos uno al lado del otro en geles de gradiente desnaturalizante, es posible detectar fragmentos que tienen mutaciones en el primer dominio de fusión (Helms, 1990). Al colocar dos muestras una al lado de la otra en el gel y permitir que se desnaturalicen juntas, los investigadores pueden ver fácilmente incluso las diferencias más pequeñas en dos muestras o fragmentos de ADN.
Hay una serie de desventajas en esta técnica: "Los gradientes químicos como los que se utilizan en DGGE no son tan reproducibles, son difíciles de establecer y, a menudo, no resuelven completamente los heterodúplex " (Westburg, 2001). Estos problemas son abordados por TGGE, que utiliza un gradiente de temperatura, en lugar de químico, para desnaturalizar la muestra.
Método
Para separar los ácidos nucleicos mediante TGGE, se deben realizar los siguientes pasos: preparación y vertido de los geles, electroforesis, tinción y elución del ADN. Debido a que se debe elegir un sistema tamponado , es importante que el sistema permanezca estable dentro del contexto de aumento de temperatura. Por tanto, la urea se utiliza típicamente para la preparación de gel; sin embargo, los investigadores deben saber que la cantidad de urea utilizada afectará la temperatura general requerida para separar el ADN. [6] Se carga el gel, se coloca la muestra sobre el gel de acuerdo con el tipo de gel que se está procesando, es decir, paralelo o perpendicular, se ajusta el voltaje y se puede dejar que la muestra se procese. [6] Dependiendo del tipo de TGGE que se vaya a ejecutar, ya sea perpendicular o paralelo , es necesario preparar y cargar diferentes cantidades de muestra. Se usa una cantidad mayor de una muestra con perpendicular, mientras que se usa una cantidad menor de muchas muestras con TGGE paralelo. Una vez que se ha corrido el gel, se debe teñir el gel para visualizar los resultados. Si bien hay una serie de tintes que se pueden utilizar para este propósito, se ha demostrado que la tinción con plata es la herramienta más eficaz. [6] El ADN se puede eluir de la tinción de plata para su posterior análisis mediante amplificación por PCR . [6]
Aplicaciones
TGGE y DGGE son ampliamente útiles en la investigación biomédica y ecológica; las aplicaciones seleccionadas se describen a continuación.
Mutaciones en el mtDNA
Según una investigación reciente de Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper y Gropman, [ cita requerida ] TGGE se puede utilizar para examinar el ADN mitocondrial de un individuo. Según estos autores, se utilizó TGGE para determinar dos mutaciones novedosas en el genoma mitocondrial : "Se examinó una mujer de 21 años de edad que se sospechaba de citopatía mitocondrial, pero negativa para mutaciones puntuales y deleciones del ADN mitocondrial común (ADNmt). para mutaciones desconocidas en todo el genoma mitocondrial mediante electroforesis en gel de gradiente de temperatura ". [7]
mutación p53 en secreciones pancreáticas
Lohr y colaboradores (2001) informan [ cita requerida ] que en un estudio exhaustivo de las secreciones pancreáticas de individuos sin carcinoma pancreático , se pudieron encontrar mutaciones de p53 en los jugos pancreáticos de un pequeño porcentaje de participantes. Debido a que las mutaciones de p53 se han encontrado ampliamente en los carcinomas de páncreas, los investigadores de esta investigación estaban intentando determinar si la mutación en sí misma puede estar relacionada con el desarrollo de cáncer de páncreas. Si bien Lohr pudo encontrar mutaciones de p53 a través de TGGE en algunos sujetos, ninguno desarrolló posteriormente carcinoma pancreático. Por lo tanto, los investigadores concluyen señalando que la mutación p53 puede no ser el único indicador de la oncogénesis del carcinoma pancreático.
Ecología microbiana
La DGGE de genes codificadores de subunidades ribosómicas pequeñas fue descrita por primera vez por Gerard Muyzer , [8] mientras era postdoctorado en la Universidad de Leiden , y se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en ecología microbiana.
La amplificación por PCR de ADN extraído de comunidades microbianas mixtas con cebadores de PCR específicos para fragmentos de genes de ARNr 16S de bacterias y arqueas , y fragmentos de genes de ARNr 18S de eucariotas da como resultado mezclas de productos de PCR. Debido a que todos estos amplicones tienen la misma longitud, no se pueden separar entre sí mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las variaciones de secuencia (es decir, diferencias en el contenido y distribución de GC) entre diferentes rRNA microbianos dan como resultado diferentes propiedades de desnaturalización de estas moléculas de ADN.
Por lo tanto, los patrones de bandas de DGGE se pueden utilizar para visualizar variaciones en la diversidad genética microbiana y proporcionar una estimación aproximada de la riqueza de abundancia de los miembros predominantes de la comunidad microbiana. Este método a menudo se conoce como toma de huellas dactilares de la comunidad . Recientemente, varios estudios han demostrado que la DGGE de genes funcionales (por ejemplo, genes implicados en la reducción de azufre, fijación de nitrógeno y oxidación de amonio) pueden proporcionar información sobre la función microbiana y la filogenia simultáneamente. Por ejemplo, Tabatabaei et al. (2009) aplicaron DGGE y lograron revelar el patrón microbiano durante la fermentación anaeróbica del efluente del molino de aceite de palma (POME) por primera vez. [9]
Referencias
- ^ Celda. Enero de 1979; 16 (1): 191-200. Separación independiente de la longitud de fragmentos de restricción de ADN en electroforesis en gel bidimensional. Fischer SG, Lerman LS
- ^ Fischer SG y Lerman LS "Separación de fragmentos aleatorios de ADN según las propiedades de sus secuencias" Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1980, 77, 4420-4424.
- ^ Fischer SG y Lerman LS "Los fragmentos de ADN que se diferencian por sustituciones de un solo par de bases se separan en geles de gradiente desnaturalizante: Correspondencia con la teoría de fusión" Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1983, 80, 1579-1583.
- ^ J Mol Biol. 7 de octubre de 1994; 242 (5): 670-82. Caracterización electroforética de los estados desnaturalizados de la nucleasa estafilocócica. Creighton TE, Shortle D.
- ^ Bioochem. J. (1981) 197, 105-109
- ↑ a b c d (Biometra, 2000). [ cita requerida ]
- ^ (Wong et al., 2002). [ cita requerida ]
- ^ Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993) Perfilado de poblaciones microbianas complejas mediante análisis de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante de genes amplificados por reacción en cadena de la polimerasa que codifican ARNr 16S. Appl Environ Microbiol. 59: 695-700.
- ^ Análisis de DGGE y FISH basado en PCR de metanógenos en un tanque de digestor cerrado anaeróbico que trata el efluente del molino de aceite de palma. Meisam Tabatabaei, Mohd Rafein Zakaria, Raha Abdul Rahim, André-Denis G. Wright, Yoshihito Shirai, Norhani Abdullah, Kenji Sakai, Shinya Ikeno, Masatsugu Mori, Nakamura Kazunori, Alawi Sulaiman y Mohd Ali Hassan Journal of Biotechnology, 2009, Vol.12 No.3, Edición del 15 de julio de 2009, ISSN 0717-3458
- Charles J. Sailey, MD, MS Partes extraídas de un documento de resumen titulado "TGGE". 2003. Universidad de las Ciencias de Filadelfia.