Las células madre embrionarias son capaces de autorrenovarse y diferenciarse al destino deseado dependiendo de su posición dentro del cuerpo. La homeostasis de las células madre se mantiene a través de mecanismos epigenéticos que son altamente dinámicos en la regulación de la estructura de la cromatina , así como programas específicos de transcripción de genes . [1] La epigenética se ha utilizado para referirse a cambios en la expresión génica , que son heredables a través de modificaciones que no afectan la secuencia de ADN . [2]
El epigenoma de los mamíferos sufre una remodelación global durante el desarrollo temprano de las células madre que requiere que las células se comprometan a estar restringidas al linaje deseado . Ha habido múltiples pruebas que sugieren que el mantenimiento del compromiso de linaje de las células madre está controlado por mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN , las modificaciones de histonas y la regulación de la remodelación de la estructura de la cromatina dependiente de ATP . [1] [3] Basado en la hipótesis del código de histonas , distintas modificaciones de histonas covalentes pueden conducir a estructuras de cromatina funcionalmente distintas que influyen en el destino de la célula.
Esta regulación de la cromatina a través de modificaciones epigenéticas es un mecanismo molecular que determinará si la célula seguirá diferenciándose en el destino deseado. Un estudio de investigación realizado por Lee et al. examinaron los efectos de las modificaciones epigenéticas en la estructura de la cromatina y la modulación de estos marcadores epigenéticos durante la diferenciación de células madre a través de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias (ES) murinas . [4]
Antecedentes experimentales
Las células madre embrionarias exhiben alteraciones dramáticas y complejas en las estructuras de cromatina tanto globales como específicas del sitio . Lee y col. realizaron un experimento para determinar la importancia de la desacetilación y acetilación para la diferenciación de células madre al observar los niveles globales de acetilación y metilación en ciertas modificaciones específicas de sitio en los sitios de histonas H3K9 y H3K4 . La expresión génica en estas histonas reguladas por modificaciones epigenéticas es fundamental para restringir la célula madre embrionaria a los linajes celulares deseados y desarrollar la memoria celular .
Para las células de mamíferos, el mantenimiento de la metilación de la citosina está catalizado por las metiltransferasas de ADN y cualquier alteración de estas metiltransferasas provocará un fenotipo letal para el embrión. La metilación de la citosina se examina en H3K9 , que está asociada con la heterocromatina inactiva y ocurre principalmente en los dinucleótidos CpG, mientras que la acetilación global se examina en H3K4 , que está asociada con la eucromatina activa . El genoma cigótico de los mamíferos se somete a una desmetilación de citosina global activa y pasiva después de la fertilización que alcanza un punto mínimo de metilación de CpG al 20% en la etapa de blastocisto, a lo que sigue una ola de metilación que reprograma la estructura de la cromatina para restaurar los niveles globales de CpG. metilación al 60%. [4] Las células madre embrionarias que contienen niveles reducidos o elevados de metilación son viables pero no pueden diferenciarse y, por lo tanto, requieren una regulación crítica de la metilación de citosina para el desarrollo de los mamíferos .
Efectos de las modificaciones globales de las histonas durante la diferenciación de células madre embrionarias
Las modificaciones de las histonas en la cromatina se analizaron en varios intervalos de tiempo (a lo largo de un período de 6 días) tras el inicio de la diferenciación de células madre embrionarias in vitro . La eliminación del factor inhibidor de la leucemia (LIF) desencadena la diferenciación. Los datos representativos de las modificaciones de histonas en los sitios específicos después de la eliminación de LIF, evaluados mediante transferencia Western , confirman una fuerte desacetilación en las posiciones H3K4 y H3K9 en la histona H3 después de un día, seguido de un pequeño aumento en la acetilación el día dos [ cita requerida ] .
La metilación de la histona H3K4 también disminuyó después de un día de eliminación de LIF, pero mostró un rebote entre los días 2 y 4 de diferenciación, y finalmente terminó con una disminución de la metilación el día cinco. Estos resultados indican una disminución en el nivel de marcas epigenéticas de eucromatina activa tras el inicio de la diferenciación de células madre embrionarias que es seguida inmediatamente por la reprogramación del epigenoma.
Las modificaciones de histonas de la posición H3K9 muestran una disminución en la di y trimetilación de células madre embrionarias indiferenciadas y tuvieron un aumento gradual en la metilación durante el curso de seis días de diferenciación in vitro, lo que indicó que hay un aumento global de heterocromatina inactiva. niveles en esta marca de histonas. [ cita requerida ]
A medida que la célula madre embrionaria experimenta diferenciación, los marcadores de eucromatina activa (acetilación de histonas y metilación de H3K4 ) disminuyen después de la eliminación de LIF, lo que muestra que la célula se está diferenciando más. El ligero rebote en cada una de estas marcas permite que se produzca una mayor diferenciación al permitir otra oportunidad para disminuir los marcadores una vez más, acercando la célula a su estado maduro. Dado que también hay un aumento durante el período de seis días en H3K9me , un marcador para la heterocromatina activa, una vez que ocurre la diferenciación se concluye que la formación de heterocromatina ocurre cuando la célula se diferencia en su destino deseado haciendo que la célula sea inactiva para evitar una mayor diferenciación. .
Metilación del ADN en células diferenciadas versus indiferenciadas
Se compararon los niveles globales de 5-metilcitosina entre células madre embrionarias diferenciadas e indiferenciadas in vitro. El patrón de metilación de citosina global parece establecerse antes de la reprogramación del código de histonas que se produce tras la diferenciación in vitro de las células madre embrionarias.
A medida que la célula madre embrionaria experimenta diferenciación, aumenta el nivel de metilación del ADN. Esto indica que hay un aumento de heterocromatina inactiva durante la diferenciación.
Efectos suplementarios de la metilación con DNMT
En los mamíferos, la metilación del ADN juega un papel en la regulación de un componente clave de la multipotencia: la capacidad de autorrenovarse rápidamente. Khavari y col. discutieron los mecanismos fundamentales de la metilación del ADN y la interacción con varias vías que regulan la diferenciación. [5] Los nuevos enfoques que estudian el estado genómico de la metilación del ADN en varios estados de diferenciación han demostrado que la metilación en los sitios CpG asociados con potenciadores putativos son importantes en este proceso. La metilación del ADN puede modular las afinidades de unión de los factores de transcripción mediante el reclutamiento de represores tales como MeCP2 que muestran especificidad de unión para secuencias que contienen dinucleótidos CpG metilados. La metilación del ADN está controlada por determinadas metiltransferasas , DMNT , que realizan diferentes funciones dependiendo de cada una. Tanto DNMT3A como DNMT3B se han relacionado con un papel en el establecimiento del patrón de metilación del ADN en el desarrollo temprano de la célula madre, mientras que se requiere DNMT1 para metilar una hebra de ADN recién sintetizada después de que la célula se haya replicado para mantener la epigenética. Estado regulador. Numerosas proteínas pueden interactuar físicamente con los DNMT , lo que ayuda a dirigir DNMT1 al ADN hemi-metilado .
Varios nuevos [ ¿cuándo? ] los estudios apuntan al papel central de la metilación del ADN que interactúa con la regulación de los ciclos celulares y las vías de reparación del ADN para mantener el estado indiferenciado . En las células madre embrionarias, el agotamiento de DNMT1 dentro del compartimento de células progenitoras indiferenciadas condujo a la detención del ciclo celular, la diferenciación prematura y una falla en la autorrenovación del tejido. La pérdida de DNMT1 se produjo por efectos profundos asociados con la activación de genes de diferenciación y la pérdida de genes que promueven la progresión del ciclo celular, lo que indica que DNMT1 y otros DNMT no suprimen continuamente la diferenciación y, por lo tanto, mantienen el estado pluripotente .
Estos estudios señalan la importancia de la interacción de las DNMT para mantener los estados de las células madre, lo que permite que se produzca una mayor diferenciación y formación de heterocromatina.
Modificaciones epigenéticas de genes regulados durante la diferenciación de ESC
Okamoto y col. previamente documentaron la disminución del nivel de expresión del gen Oct4 con la diferenciación de células madre embrionarias. [6] Lee y col. realizó un análisis de ChIP del promotor Oct4, asociado con células indiferenciadas, región para examinar las modificaciones epigenéticas de genes regulados en desarrollo durante la diferenciación de células madre embrionarias. Esta región promotora disminuyó en los sitios de metilación de H3K4 y acetilación de H3K9 y aumentó en el sitio de metilación de H3K9 durante la diferenciación. El análisis de un motivo CpG del promotor del gen Oct4 reveló un aumento progresivo de la metilación del ADN y estaba completamente metilado en el día 10 de diferenciación, como se informó previamente en Gidekel y Bergman. [7]
Estos resultados indican que hubo un cambio de la eurchromatina activa a la heterocromatina inactiva debido a la disminución de la acetilación de H3K4 y un aumento de H3K9me. Esto significa que la célula se está diferenciando en el gen Oct4, que coincide con el silencio de la expresión del gen Oct4.
Otro gen específico de sitio probado para la modificación de histonas fue un gen de Brachyury , un marcador de diferenciación del mesodermo y solo se expresa ligeramente en células madre embrionarias indiferenciadas. Se indujo "brachyury" en el día cinco de diferenciación y se silenció completamente el día 10, correspondiente al último día de diferenciación. [8] El análisis de ChIP del promotor del gen "Brachyury" reveló un aumento de la expresión en la mono y di-metilación de H3K4 en los días 0 y 5 de la diferenciación de células madre embrionarias con una pérdida de expresión génica en el día 10. La trimetilación de H3K4 coincide con el momento de mayor expresión génica de Brachyury ya que solo tenía expresión génica el día 5. Las metilaciones de H3K4 en todas sus formas están ausentes en el día 10 de diferenciación, lo que se correlaciona con el silenciamiento de la expresión del gen Brachyury. La monometilación de ambas histonas produjo expresión en el día 0, lo que indica un marcador que no es útil para la estructura de la cromatina. La acetilación de H3K9 no se correlaciona con la expresión del gen Brachyury ya que estaba regulada negativamente en la inducción de la diferenciación. Tras examinar la expresión de metilación del ADN, no hubo formación de mal de tamaño intermedio en el análisis de Southern, lo que sugiere que los motivos CpG cadena arriba de la región promotora no están metilados en ausencia de metilación de citosina en este sitio.
Se demuestra a partir de estos estudios que tanto la di y tri-metilación de H3K9 se correlacionan con la metilación del ADN y la expresión génica, mientras que la tri-metilación de H3K4 se asocia con la etapa de expresión génica más alta del gen Brachyury . Un informe anterior de Santos-Rosa está de acuerdo con estos datos que muestran que los genes activos están asociados con la trimetilación de H3K4 en la levadura. [9]
Estos datos indicaron los mismos resultados que para el gen Oct4 , en el sentido de que se está formando heterocromatina a medida que se produce la diferenciación, coincidiendo de nuevo con el silencio de la expresión del gen Brachyury .
Efecto de la TSA en la diferenciación de células madre
El factor inhibidor de la leucemia (LIF) se eliminó de todas las líneas celulares . LIF inhibe la diferenciación celular y su eliminación permite que las líneas celulares pasen por la diferenciación celular. Las líneas celulares se trataron con Tricostatina A (TSA), un inhibidor de histona desacetilasa durante 6 días. Un grupo de líneas celulares se trató con 10 nM de TSA. El análisis occidental mostró la falta de desacetilación inicial el día 1 que se observó en el control para la diferenciación de células madre embrionarias. La falta de actividad histona desacetilasa permitió la acetilación de H3K9 e histona H4 . Las células madre embrionarias también se analizaron morfológicamente para observar la formación de cuerpos embrionarios como una de las medidas de diferenciación celular. Las células tratadas con TSA 10 nM no pudieron formar el cuerpo embrioide el día 6 como se observó en la línea celular de control. Esto implica que las células madre embrionarias tratadas con TSA carecían de desacetilación el día 1 y no lograron diferenciarse después de la eliminación de LIF. El segundo grupo, '- TSA Day4' se trató con TSA durante 3 días. Tan pronto como se detuvo el tratamiento con TSA, el día 4 se observó la desacetilación y la acetilación se recuperó el día 5. El examen morfológico mostró la formación de cuerpos embrioides en el día 6. Además, la formación del cuerpo embrioide fue más rápida que la línea celular de control. Esto sugiere que las líneas '-TSA Day4' respondían a la eliminación de LIF pero no pudieron adquirir ningún fenotipo de diferenciación. Pudieron adquirir el fenotipo de diferenciación después del cese del tratamiento con TSA y a un ritmo rápido. El examen morfológico del tercer grupo, "5 nM TSA" mostró el efecto intermedio entre el control y el grupo 10 nM-TSA. La dosis más baja de TSA permitió la formación de algunos cuerpos embrioides. Este experimento muestra que TSA inhibe la histona desacetilasa y se requiere la actividad de la histona desacetilasa para la diferenciación de células madre embrionarias. Sin la desacetilación inicial el día 1, las células madre embrionarias no pueden pasar por la diferenciación. [ cita requerida ]
Actividad de la fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas que se encuentran en los seres humanos son glicoproteínas unidas a la membrana, que funcionan para catalizar la hidrólisis de los ésteres de monofosfato. McKenna y col. (1979) encontraron que hay al menos tres variedades de fosfatasas alcalinas, fosfatasas alcalinas de riñón, hígado y huesos, que están codificadas por el mismo gen estructural, pero contienen restos de carbohidratos no idénticos. Las variedades de fosfatasa alcalina, por lo tanto, expresan un complemento único en los procesos enzimáticos en la glicosilación postraduccional de proteínas. [10]
En las células madre normales, la actividad de la fosfatasa alcalina disminuye con la diferenciación. La tricostatina A hace que las células mantengan la actividad de la fosfatasa alcalina. La tricostatina A puede causar una inhibición reversible de la histona desacetilasa de mamíferos, lo que conduce a la inhibición del crecimiento celular Se observó un aumento significativo en la extinción de la fosfatasa alcalina cuando se retiró la tricostatina A después de tres días. La actividad de la fosfatasa alcalina se correlaciona con los cambios morfológicos. Se requiere la desacetilación inicial de histonas para la diferenciación de células madre embrionarias. [ cita requerida ] [11]
HDAC1, pero no HDAC2 controla la diferenciación
Dovery y col. (2010) utilizaron ratones knockout para HDAC para demostrar si HDAC1 o HDAC2 era importante para la diferenciación de células madre embrionarias. El examen de la acetilación global de histonas en ausencia de HDAC 1 mostró un aumento en la acetilación. Los niveles globales de acetilación de histonas se mantuvieron sin cambios por la pérdida de HDAC2. Para analizar en detalle el proceso del ratón knockout para HDAC, se utilizaron las células madre embrionarias de los ratones knockout para generar cuerpos embrioides. Mostró que justo antes o durante la gastrulación , las células madre embrionarias que carecen de HDAC1 adquirieron defectos de desarrollo visibles. El cultivo continuo de células madre embrionarias knockout HDAC1 mostró que los cuerpos embrioides formados se volvieron irregulares y reducidos en tamaño en lugar de uniformemente esféricos como en ratones normales. La proliferación de células madre embrionarias no se vio afectada por la pérdida de HDAC1 o HDAC2, pero la diferenciación de las células madre embrionarias se vio afectada por la falta de HDAC 1. Esto muestra que la HDAC1 es necesaria para la determinación del destino celular durante la diferenciación. [12]
El futuro
Cualquier perturbación de una regulación epigenética estable de la expresión génica mediada por metilación del ADN se asocia con una serie de trastornos humanos, incluyendo el cáncer, así como enfermedades congénitas tales como tipo seudohipoparatiroidismo IA , Beckwith-Wiedemann , síndrome de Prader-Willi y Angelman , que son cada causada por una impronta basada en metilación alterada en loci específicos.
Las perturbaciones de los patrones de metilación de citosina tanto globales como específicos de genes se observan comúnmente en el cáncer, mientras que la desacetilación de histonas es una característica importante de la reprogramación nuclear en los ovocitos durante la meiosis . [13]
Estudios recientes han revelado que existe una variedad de vías diferentes que cooperan entre sí para otorgar una regulación epigenética adecuada mediante la metilación del ADN. Se necesitarán estudios futuros para aclarar aún más las vías de ciertos mecanismos, como las proteínas de unión al ADN , la reparación del ADN y los ARN no codificantes que sirven para regular la metilación del ADN para suprimir la diferenciación y mantener la autorrenovación en las células madre somáticas en la epidermis y otros tejidos. Abordar estas preguntas ayudará a ampliar la comprensión de estos hallazgos recientes para un papel central en los reguladores epigenéticos de la metilación del ADN en el control de la diferenciación de células madre embrionarias. [5]
Referencias
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