FAST ( etiqueta de cambio de absorción y activación de fluorescencia ) es una pequeña etiqueta de proteína codificada genéticamenteque permite el informe de fluorescencia de proteínas de interés. A diferencia de las proteínas fluorescentes naturales y sus derivados como GFP o mCherry, FAST no es fluorescente por sí mismo. Puede unirse selectivamente a un cromóforo fluorogénico derivado de 4-hidroxibencilideno rodanina (HBR), que en sí mismo no es fluorescente a menos que esté unido. Una vez unidas, el par de moléculas pasa por un mecanismo de activación de fluorógeno único basado en dos cambios espectroscópicos, aumento del rendimiento cuántico de fluorescencia y desplazamiento al rojo de absorción, lo que proporciona una alta selectividad de marcado. El sistema de informes FAST-fluorógeno se puede utilizar en microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y cualquier otro método fluorométrico para explorar el mundo viviente: biosensores, tráfico de proteínas.
FAST, una proteína pequeña de 14 kDa, se diseñó a partir de la proteína amarilla fotoactiva (PYP) mediante evolución dirigida. Fue informado por primera vez en 2016 por investigadores de Ecole normale supérieure de Paris . [1]
Mecanismo
FAST pertenece a una estrategia químico-genética para el etiquetado específico de proteínas. Un dominio peptídico, denominado "etiqueta", está codificado genéticamente para unirse a una proteína de interés (mediante la combinación de sus genes respectivos mediante transfección o infección). Esta etiqueta es el ancla para agregar una sonda fluorescente sintética. [2] Dicho enfoque químico-genético ya se implementó además de proteínas fluorescentes naturales como GFP o sus derivados como mCherry en varios sistemas ya ampliamente utilizados:
- desde 2003, SNAP-tag , un sistema de notificación de dos componentes que consta de un péptido de 19 kDa derivado de una enzima humana, O 6 -metilguanina-ADN metiltransferasa, evolucionó para formar enlaces covalentes con derivados fluorescentes de O 6 -bencilguanina; La etiqueta SNAP evolucionó posteriormente a una etiqueta ortogonal, etiqueta CLIP ;
- desde 2008, HaloTag , un sistema de notificación de dos componentes que consta de un péptido de 33 kDa derivado de una enzima bacteriana, una haloalcano deshalogenasa, que puede unirse específicamente a ligandos sintéticos halogenados funcionales, con mayor frecuencia fluorescentes para la obtención de imágenes celulares ( p . ej. , cumarina, verde de Oregon, Alexa Fluor 488, diAcFAM, TMR).
Se han descrito varias versiones de FAST que se diferencian por un pequeño número de mutaciones, por ejemplo , FAST1 (también conocido como Y-FAST), FAST2 (también conocido como iFAST), o un dímero, td-FAST. [3] Además, se desarrolló una versión dividida de complementación para monitorear las interacciones proteína-proteína, splitFAST. [4] Varios plásmidos que muestran genes FAST o splitFAST están disponibles en Addgene. [5]
Aplicaciones
El sistema de informes FAST-fluorógeno se utiliza en microscopía de fluorescencia , citometría de flujo y cualquier otro método fluorométrico para explorar el mundo de los seres vivos, incluidos los biosensores y el tráfico de proteínas . Se ha informado de FAST para la obtención de imágenes dinámicas de biopelículas debido a su capacidad única de fluorescencia en condiciones de bajo oxígeno. [6] Por la misma razón, permite la obtención de imágenes y FACSing de anaerobios, como Clostridium , utilizados para la fermentación de biomasa como la fermentación ABE . [7] También se ha informado de FAST para microscopía de superresolución de células vivas. [8]
The Twinkle Factory desarrolló varios fluorógenos para FAST y sus derivados, que varían según su longitud de onda de emisión, su brillo y su afinidad de etiqueta. Algunas no son permeables, es decir , no pueden atravesar las membranas celulares, por lo que etiquetan específicamente las proteínas de la membrana o las proteínas extracelulares, lo que permite, por ejemplo , controlar el tráfico desde la síntesis hasta la excreción. [9]
Referencias
- ^ Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurin, Sylvie; Gauron, Carole; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyan; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (28 de diciembre de 2015). "Etiqueta de cambio de absorción y activación de fluorescencia pequeña para imágenes de proteínas sintonizables in vivo" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 113 (3): 497–502. doi : 10.1073 / pnas.1513094113 . ISSN 0027-8424 . PMC 4725535 . PMID 26711992 .
- ^ Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurin, Sylvie; Gauron, Carole; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyan; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (19 de enero de 2016). "Etiqueta de cambio de absorción y activación de fluorescencia pequeña para imágenes de proteínas sintonizables in vivo" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 113 (3): 497–502. Código bibliográfico : 2016PNAS..113..497P . doi : 10.1073 / pnas.1513094113 . ISSN 0027-8424 . PMC 4725535 . PMID 26711992 .
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- ^ Tebo, Alison G .; Gautier, Arnaud (14 de agosto de 2019). "Corrección de autor: un reportero fluorescente dividido con complementación rápida y reversible" . Comunicaciones de la naturaleza . 10 (1): 3730. Código Bibliográfico : 2019NatCo..10.3730T . doi : 10.1038 / s41467-019-11689-6 . ISSN 2041-1723 . PMC 6694131 . PMID 31413330 .
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