Un fluorómetro o fluorímetro es un dispositivo que se utiliza para medir parámetros de fluorescencia del espectro visible : su intensidad y distribución de longitud de onda del espectro de emisión después de la excitación por un cierto espectro de luz. [1] Estos parámetros se utilizan para identificar la presencia y la cantidad de moléculas específicas en un medio. Los fluorómetros modernos son capaces de detectar concentraciones de moléculas fluorescentes tan bajas como 1 parte por billón.
El análisis de fluorescencia puede ser órdenes de magnitud más sensibles que otras técnicas. Las aplicaciones incluyen química / bioquímica , medicina , monitoreo ambiental . Por ejemplo, se utilizan para medir la fluorescencia de la clorofila para investigar la fisiología de las plantas .
Componentes y diseño
Normalmente, los fluorómetros utilizan un haz doble. Estos dos haces funcionan en conjunto para disminuir el ruido creado por las fluctuaciones de la potencia radiante. El haz superior pasa a través de un filtro o monocromador y pasa a través de la muestra. El haz inferior pasa a través de un atenuador y se ajusta para intentar igualar la potencia fluorescente emitida por la muestra. La luz de la fluorescencia de la muestra y el haz atenuado inferior son detectados por transductores separados y convertidos en una señal eléctrica que es interpretada por un sistema informático.
Dentro de la máquina, el transductor que detecta la fluorescencia creada a partir del haz superior se encuentra a una distancia de la muestra y en un ángulo de 90 grados desde el haz superior incidente. La máquina está construida de esta manera para disminuir la luz parásita del haz superior que puede llegar al detector. El ángulo óptimo es de 90 grados. Hay dos enfoques diferentes para manejar la selección de la luz incidente que da paso a diferentes tipos de fluorómetros. Si se utilizan filtros para seleccionar longitudes de onda de luz, la máquina se llama fluorómetro. Mientras que un espectrofluorómetro normalmente usará dos monocromadores, algunos espectrofluorómetros pueden usar un filtro y un monocromador. Donde, en este caso, el filtro de banda ancha actúa para reducir la luz parásita, incluso de órdenes de difracción no deseadas de la rejilla de difracción en el monocromador.
Las fuentes de luz para los fluorómetros a menudo dependen del tipo de muestra que se analiza. Entre las fuentes de luz más comunes para los fluorómetros se encuentra la lámpara de mercurio de baja presión . Esto proporciona muchas longitudes de onda de excitación, lo que lo convierte en el más versátil. Sin embargo, esta lámpara no es una fuente continua de radiación. La lámpara de arco de xenón se utiliza cuando se necesita una fuente continua de radiación. Ambas fuentes proporcionan un espectro adecuado de luz ultravioleta que induce quimioluminiscencia . Estas son solo dos de las muchas fuentes de luz posibles. [ cita requerida ]
Las cubetas de vidrio y sílice suelen ser los recipientes en los que se coloca la muestra. Se debe tener cuidado de no dejar huellas dactilares o cualquier otro tipo de marca en el exterior de la cubeta, ya que esto puede producir una fluorescencia no deseada. A veces se utilizan disolventes de "grado espectro", como el metanol, para limpiar las superficies de los recipientes para minimizar estos problemas.
Usos
Industria láctea
La fluorimetría es ampliamente utilizada por la industria láctea para verificar si la pasteurización ha tenido éxito. Esto se hace usando un reactivo que se hidroliza a un fluoróforo y ácido fosfórico mediante la fosfatasa alcalina en la leche. [2] Si la pasteurización ha tenido éxito, la fosfatasa alcalina se desnaturalizará por completo y la muestra no emitirá fluorescencia. Esto funciona porque los patógenos en la leche son eliminados por cualquier tratamiento térmico que desnaturalice la fosfatasa alcalina. [3] [4]
Los productores de leche del Reino Unido requieren ensayos de fluorescencia para demostrar que ha tenido lugar una pasteurización exitosa, [5] por lo que todas las lecherías del Reino Unido contienen equipo de fluorimetría.
Agregación de proteínas y detección de TSE
Las tioflavinas son colorantes que se utilizan para la tinción histológica y los estudios biofísicos de agregación de proteínas. [6] Por ejemplo, la tioflavina T se usa en la técnica RT-QuIC para detectar encefalopatía espongiforme transmisible que causa priones mal plegados .
Oceanografía
Los fluorómetros se utilizan ampliamente en estudios oceanográficos para medir los niveles de clorofila y, por lo tanto, deducir cantidades de algas en el agua. Esto es particularmente importante para que las granjas de peces detecten la aparición de una floración de algas nocivas (HAB).
Biología Molecular
Se pueden usar fluorómetros para determinar la concentración de ácido nucleico en una muestra. [7]
Tipos de fluorómetros
Hay dos tipos básicos de fluorómetros: los fluorómetros de filtro y el espectrofluorómetro. La diferencia entre ellos es la forma en que seleccionan las longitudes de onda de la luz incidente; Los fluorómetros de filtro usan filtros, mientras que los espectrofluorómetros usan monocromadores de rejilla. Los fluorómetros de filtro a menudo se compran o fabrican a un costo menor, pero son menos sensibles y tienen menos resolución que los espectrofluorómetros. Los fluorómetros de filtro también pueden funcionar solo en las longitudes de onda de los filtros disponibles, mientras que los monocromadores generalmente se pueden sintonizar libremente en un rango relativamente amplio. La desventaja potencial de los monocromadores surge de esa misma propiedad, porque el monocromador es capaz de mal calibrado o desajuste, donde la longitud de onda de los filtros se fija cuando se fabrica.
Ver también
- Espectroscopia de fluorescencia , para una discusión más completa de la instrumentación.
- Fluorescencia de clorofila , para investigar la ecofisiología de las plantas.
- Fluorómetro integrado para medir el intercambio de gases y la fluorescencia de la clorofila de las hojas.
- Radiómetro , para medir diversas radiaciones electromagnéticas.
- Espectrómetro , para analizar el espectro de radiación electromagnética.
- Dispersómetro , para medir la radiación dispersa
- Microfluorimetría , para medir la fluorescencia a nivel microscópico
- Filtro de interferencia , filtros de película fina que funcionan por interferencia óptica, mostrando cómo se pueden sintonizar en algunos casos.
Referencias
- ^ "Espectrofotometría de fluorescencia" . Enciclopedia de Ciencias de la Vida . Macmillan Publishers Ltd. 2002.
- ^ Langridge, E W. La determinación de la actividad fosfatasa . Calidad Management Ltd . Consultado el 20 de diciembre de 2013 .
- ^ Kay, H. (1935). "Algunos Resultados de la Aplicación de una Prueba Sencilla de Eficiencia de Pasteurización". The Lancet . 225 (5835): 1516-1518. doi : 10.1016 / S0140-6736 (01) 12532-8 .
- ^ Hoy, WA; Neave, FK (1937). "La prueba de fosfatasa para una pasteurización eficiente". The Lancet . 230 (5949): 595. doi : 10.1016 / S0140-6736 (00) 83378-4 .
- ^ BS EN ISO 11816-1: 2013
- ^ Biancalana M, Koide S (julio de 2010). "Mecanismo molecular de la unión de tioflavina-T a fibrillas de amiloide" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteínas y proteómica . 1804 (7): 1405-12. doi : 10.1016 / j.bbapap.2010.04.001 . PMC 2880406 . PMID 20399286 .
- ^ Mészáros, Éva (2021). "Determinar la concentración y pureza de los ácidos nucleicos" . INTEGRA Biociencias .