En biología molecular , un gen informador (a menudo simplemente informador ) es un gen que los investigadores adjuntan a una secuencia reguladora de otro gen de interés en bacterias , cultivos celulares , animales o plantas. Estos genes se denominan indicadores porque las características que confieren a los organismos que los expresan se identifican y miden fácilmente o porque son marcadores seleccionables . Los genes informadores se utilizan a menudo como una indicación de si un determinado gen ha sido incorporado o expresado en la población de células u organismos.
Genes reporteros comunes
Para introducir un gen informador en un organismo, los científicos colocan el gen informador y el gen de interés en la misma construcción de ADN para insertarlo en la célula u organismo. En el caso de bacterias o células procariotas en cultivo, suele presentarse en forma de una molécula de ADN circular llamada plásmido . Es importante utilizar un gen informador que no se exprese de forma nativa en la célula u organismo en estudio, ya que la expresión del informador se utiliza como marcador para la captación satisfactoria del gen de interés. [1]
Los genes informadores de uso común que inducen características identificables visualmente generalmente involucran proteínas fluorescentes y luminiscentes . Los ejemplos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (GFP), que hace que las células que la expresan brillen en verde bajo la luz azul, la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína roja fluorescente del gen dsRed . [2] [3] [4] [5] [6] El gen GUS se ha utilizado comúnmente en plantas, pero la luciferasa y la GFP se están volviendo más comunes. [7] [8]
Un informador común en bacterias es el gen lacZ de E. coli , que codifica la proteína beta-galactosidasa . [9] Esta enzima hace que las bacterias que expresan el gen parezcan azules cuando se cultivan en un medio que contiene el análogo de sustrato X-gal . Un ejemplo de un marcador seleccionable que también es un indicador en bacterias es el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol . [10]
Nombre del gen | Producto genético | Ensayo | Árbitro. |
---|---|---|---|
lacZ | β-galactosidasa | Ensayo enzimático, histoquímico | [9] |
gato | Cloranfenicol acetiltransferasa | cloranfenicol acetilación | [10] |
gfp | Proteína verde fluorescente | Fluorescente | [2] |
rfp | Proteína roja fluorescente | Microscópico , Espectrofotometría | [11] |
luc | Enzima luciferasa | Bioluminiscencia | [3] |
Ensayos de transformación y transfección
Muchos métodos de transfección y transformación , dos formas de expresar un gen extraño o modificado en un organismo, son efectivos solo en un pequeño porcentaje de una población sometida a las técnicas. [12] [13] Por lo tanto, es necesario un método para identificar esos pocos eventos exitosos de captación de genes. Los genes informadores utilizados de esta manera se expresan normalmente bajo su propio promotor (regiones de ADN que inician la transcripción del gen) independientemente del gen de interés introducido; el gen informador puede expresarse constitutivamente (es decir, está "siempre activo") o induciblemente con una intervención externa tal como la introducción de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el sistema de β-galactosidasa. [9] Como resultado, la expresión del gen informador es independiente de la expresión del gen de interés, lo cual es una ventaja cuando el gen de interés solo se expresa en determinadas condiciones específicas o en tejidos de difícil acceso. [1]
En el caso de indicadores de marcadores seleccionables como CAT, la población de bacterias transfectadas se puede cultivar en un sustrato que contiene cloranfenicol . Solo aquellas células que han incorporado con éxito la construcción que contiene el gen CAT sobrevivirán y se multiplicarán en estas condiciones. [10]
Ensayos de expresión génica
Los genes indicadores pueden usarse para analizar la expresión de un gen de interés que normalmente es difícil de analizar cuantitativamente. [1] Los genes informadores pueden producir una proteína que tiene poco efecto obvio o inmediato sobre el cultivo celular o el organismo. Idealmente, no están presentes en el genoma nativo para poder aislar la expresión del gen indicador como resultado de la expresión del gen de interés. [1] [14]
Para activar los genes informadores, se pueden expresar de forma constitutiva , donde se unen directamente al gen de interés para crear una fusión de genes . [15] Este método es un ejemplo del uso de elementos que actúan en cis donde los dos genes están bajo los mismos elementos promotores y se transcriben en una sola molécula de ARN mensajero . El ARNm es luego traducido en proteína. Es importante que ambas proteínas puedan plegarse adecuadamente en sus conformaciones activas e interactuar con sus sustratos a pesar de estar fusionadas. Al construir la construcción de ADN, normalmente se incluye un segmento de ADN que codifica una región enlazadora polipeptídica flexible de modo que el informador y el producto génico sólo interfieran mínimamente entre sí. [16] [17] Los genes indicadores también pueden expresarse por inducción durante el crecimiento. En estos casos, los elementos que actúan en trans , como los factores de transcripción, se utilizan para expresar el gen indicador. [18] [19]
Los ensayos de genes informadores se han utilizado cada vez más en el cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores de moléculas pequeñas y activadores de proteínas dianas y vías para el descubrimiento de fármacos y la biología química . Debido a que las propias enzimas informadoras (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga ) pueden ser dianas directas de moléculas pequeñas y confundir la interpretación de los datos de HTS, se han desarrollado nuevos diseños informadores de coincidencia que incorporan la supresión de artefactos. [20] [21]
Ensayos de promotores
Los genes indicadores pueden usarse para analizar la actividad de un promotor particular en una célula u organismo. [22] En este caso no existe un "gen de interés" separado; el gen informador simplemente se coloca bajo el control del promotor diana y la actividad del producto del gen informador se mide cuantitativamente. Los resultados se informan normalmente en relación con la actividad bajo un promotor de "consenso" conocido por inducir una fuerte expresión génica. [23]
Usos adicionales
Un uso más complejo de genes indicadores a gran escala es el cribado de dos híbridos , cuyo objetivo es identificar proteínas que interactúan de forma nativa entre sí in vivo . [24]
Ver también
- Sistema de reportero GUS
Referencias
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enlaces externos
- Aspectos destacados de la investigación e información actualizada sobre genes reporteros.
- Tinción de embriones de ratón completos para la actividad de la β-galactosidasa (lacZ)