El ARN guía ( ARNg ) es un fragmento de ARN que funciona como guías para las enzimas que se dirigen al ARN o al ADN , con las que forman complejos . Muy a menudo, estas enzimas eliminarán, insertarán o alterarán de otro modo el ARN o ADN objetivo. Ocurren de forma natural y cumplen funciones importantes, pero también se pueden diseñar para su uso en ediciones específicas, como con CRISPR-Cas9 .
Historia
Guía de edición de ARN El ARN fue descubierto en 1990 por B. Blum, N. Bakalara y L. Simpson [1] en las mitocondrias de protistas llamados Leishmania tarentolae. El ARN guía está codificado en el ADN maxicírculo y contiene secuencias que coinciden con las de las regiones editadas del ARNm. Permiten la escisión, inserción y eliminación de bases.
Guía de ARN en protistas
Los protistas tripanosomátidos y otros cinetoplastidos tienen un nuevo proceso de modificación del ARN mitocondrial postranscripcional conocido como "edición de ARN". Tienen un gran segmento de segmentos de ADN altamente organizados en sus mitocondrias. Este ADN mitocondrial es circular y se divide en maxicírculos y minicírculos. Una célula contiene aproximadamente 20-50 máxicírculos que tienen regiones codificantes y no codificantes. La región codificante está altamente conservada (16-17 kb) y la región no codificante varía según la especie. Los minicírculos son pequeños pero más numerosos que los maxicírculos. Los minicírculos constituyen el 95% de la masa de ADN de cinetoplasto. Los maxicírculos pueden codificar " criptogenes " y algunos gRNA; los minicírculos pueden codificar la mayoría de los gRNA. 250 o más minicírculos pueden codificar hasta 1000 gRNA. Algunos genes de gRNA muestran sitios de inserción y deleción idénticos incluso si tienen secuencias diferentes, mientras que otras secuencias de gRNA no son complementarias del mRNA preeditado. Las moléculas de maxicírculos y minicírculos se catenan en una red gigante de ADN que está situada en la base del flagelo en el compartimento interno de la mitocondria única. [1]
La mayoría de las transcripciones de máxicírculo no se pueden traducir en proteínas debido a múltiples cambios de marco en las secuencias. Estos cambios de marco se corrigen después de la transcripción mediante la inserción y eliminación de residuos de uridina en sitios precisos que crean un marco de lectura abierto que se traduce en una proteína mitocondrial homóloga a las proteínas mitocondriales de otras células. Las inserciones y deleciones están mediadas por ARN de guía corta (gRNA) que codifican la información de edición en forma de secuencias complementarias (que permiten pares de bases tanto GU como GC).
Complejo gRNA-mRNA
Los ARN guía se transcriben principalmente a partir de la región intergénica del maxicírculo de ADN y son complementarios al ARNm maduro. Es importante que el ARNg interaccione inicialmente con el ARNm preeditado y luego su par de bases de la región 5 'con el ARNm complementario. El extremo 3 'del ARNg contiene una cola de oligo' U '(5-25 nucleótidos de longitud) que es una región no codificada pero que interactúa y forma un complejo estable con regiones ricas en A y G de ARNm. Este híbrido inicial ayuda en el reconocimiento del sitio de ARNm específico que se va a editar. [2]
Función
La presencia de dos genomas en la mitocondria, uno de los cuales contiene información de secuencia que corrige errores en el otro genoma, es novedosa. La edición procede generalmente de 3 'a 5' en el ARNm. El evento de edición inicial ocurre cuando un ARNg forma un dúplex de ARN con una secuencia de ARNm complementaria justo corriente abajo del sitio de edición. Esto luego recluta una serie de complejos de ribonucleoproteínas que dirigen la escisión de la primera base no emparejada adyacente al ancla de gRNA-mRNA. La uridililtransferasa inserta 'U' en el terminal 3 'y la ARN ligasa es responsable de unir dos extremos cortados. El sitio de edición aguas arriba adyacente se modifica entonces de la misma manera. Un solo gRNA generalmente codifica la información para varios sitios de edición (un "bloque" de edición), cuya edición produce un dúplex completo de gRNA / mRNA. Este proceso de modificación se denomina modelo de cascada enzimática original. [2]
En el caso de los mRNA "paneditados", [3] el dúplex se desenrolla y otro gRNA forma un dúplex con la secuencia de mRNA editada e inicia otra ronda de edición. Los ARNg superpuestos forman un "dominio" de edición. En algunos genes existen múltiples dominios de edición. El grado de edición de cualquier gen en particular varía entre las especies de tripanosomátidos. La variación consiste en la pérdida de edición en el lado 3 ', probablemente debido a la pérdida de clases de secuencias de minicírculos que codifican ARNg específicos. Se ha propuesto un modelo de retroposición para dar cuenta de la pérdida parcial, y en algunos casos completa, de la edición en la evolución. La pérdida de edición es letal en la mayoría de los casos, aunque se han observado pérdidas en antiguas cepas de laboratorio. El mantenimiento de la edición a lo largo de la larga historia evolutiva de estos antiguos protistas sugiere la presencia de una ventaja selectiva, cuya naturaleza exacta aún es incierta.
No está claro por qué los tripanosomátidos utilizan un mecanismo tan elaborado para producir ARNm. Puede haberse originado en las primeras mitocondrias del ancestro del linaje protista de kintoplastid, ya que está presente en los bodónidos que son ancestrales de los tripanosomátidos, y puede no estar presente en los euglenoides , que se ramificaron del mismo ancestro común que los cinetoplastoides. .
En el protozoario Leishmania tarentolae , 12 de los 18 genes mitocondriales se editan mediante este proceso. Uno de esos genes es Cyb. En realidad, el ARNm se edita dos veces seguidas. Para la primera edición, la secuencia relevante en el ARNm es la siguiente:
ARNm 5 'AAAGAAAAGGCUUUAACUUCAGGUUGU 3'
El extremo 3 'se usa para anclar el gRNA (gCyb-I gRNA en este caso) por apareamiento de bases (se utilizan algunos pares G / U). El extremo 5 'no coincide exactamente y una de las tres endonucleasas específicas escinde el ARNm en el sitio de emparejamiento incorrecto.
ARNg 3 'AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5'ARNm 5 'AA AGAAA AGGC UUUAACUUCAGGUUGU 3'
El ARNm ahora se "repara" agregando U en cada sitio de edición en sucesión, dando la siguiente secuencia:
ARNg 3 'AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5'ARNm 5 'UUAUUAUUUAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGU 3'
Este gen en particular tiene dos sitios de edición de ARNg superpuestos. El extremo 5 'de esta sección es el ancla 3' para otro gRNA (gCyb-II gRNA)
Guía de ARN en procariotas
CRISPR en procariotas
La mayoría de los procariotas, que abarcan bacterias y arqueas, utilizan CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) con sus enzimas Cas asociadas, como su sistema inmunológico adaptativo. Cuando los procariotas son infectados por fagos y logran defenderse del ataque, enzimas Cas específicas cortarán el ADN del fago (o ARN) e integrarán las partes entre las repeticiones de la secuencia CRISPR. Los segmentos almacenados se pueden reconocer en futuros ataques de virus y las enzimas Cas utilizarán copias de ARN de ellos, junto con sus segmentos CRISPR asociados, como ARNg para identificar las secuencias extrañas y hacerlas inofensivas.
Estructura
El ARN guía se dirige a las secuencias complementarias mediante un simple emparejamiento de bases de Watson-Crick. En el sistema CRISPR / cas de tipo II, el ARN de guía única dirige las regiones específicas del objetivo. El ARN de guía única es una combinación programada artificialmente de dos moléculas de ARN, un componente (tracrRNA ) es responsable de la actividad de la endonucleasa Cas9 y el otro (crRNA) se une a la región de ADN específica del objetivo. Por lo tanto, el ARN trans activador ( tracrRNA ) y el crRNA son dos componentes clave y están unidos por un tetraloop que da como resultado la formación de sgRNA. Los ARNtracr son pares de bases que tienen una estructura de bucle de tallo en sí mismos y se adhieren a la enzima endonucleasa . La transcripción del locus CRISPR da CRISPR RNA (crRNA) que tiene una región flanqueada por el espaciador debido a secuencias repetidas, que consta de 18-20 pares de bases. crRNA identifica la región diana complementaria específica que es escindida por Cas9 después de su unión con crRNA y tcRNA, que en conjunto se conocen como complejo efector. Con las modificaciones en las secuencias de crRNA del RNA guía, la ubicación de unión se puede cambiar y, por tanto, definirla como un programa definido por el usuario.
Aplicaciones
Diseño de gRNA
La especificidad de dirección de CRISPR-Cas9 está determinada por la secuencia de 20 nt en el extremo 5 'del gRNA. La secuencia diana deseada debe preceder al motivo adyacente del protoespaciador (PAM), que es una secuencia de ADN corta, generalmente de 2-6 pares de bases de longitud, que sigue a la región de ADN destinada a la escisión por el sistema CRISPR, como CRISPR-Cas9. El PAM es necesario para que una nucleasa Cas corte y generalmente se encuentra 3-4 nucleótidos aguas abajo del sitio de corte. Después del emparejamiento de bases del gRNA con el objetivo, Cas9 media una ruptura de doble hebra aproximadamente 3 nt aguas arriba de PAM.
El contenido de GC de la secuencia guía debe ser del 40 al 80%. El alto contenido de GC estabiliza el dúplex de ARN-ADN mientras desestabiliza la hibridación fuera del objetivo. La longitud de la secuencia guía debe estar entre 17-24 pb, notando que una secuencia más corta minimiza los efectos fuera del objetivo. Las secuencias de guía de menos de 17 pb tienen la posibilidad de apuntar a múltiples loci.
CRISPR Cas9
CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) / Cas9 es una técnica utilizada para la edición de genes y la terapia génica. Cas es una enzima endonucleasa que corta el ADN en una ubicación específica dirigida por un ARN guía. Esta es una técnica específica de un objetivo que puede introducir un gen knock out o knock in dependiendo de la vía de reparación de doble hebra. La evidencia muestra que tanto in vitro como in vivo requerían tracrRNA para Cas9 y la unión de la secuencia de ADN diana. El sistema CRISPR CAS9 consta de tres etapas principales. La primera etapa es la extensión de bases en la región del locus CRISPR mediante la adición de espaciadores de ADN extraño en la secuencia del genoma. Varias proteínas diferentes, como cas1 y cas2, ayudan a encontrar nuevos espaciadores. La siguiente etapa implica la transcripción de CRISPR: pre-crRNA (precursor CRISPR RNA) se expresan mediante la transcripción de la matriz de espaciadores repetidos CRISPR. Tras una modificación adicional en el pre-crRNA, se convierten en regiones flanqueadas por un solo espaciador que forman crRNA corto. El proceso de maduración del ARN es similar en el tipo I y II pero diferente en el tipo III; en este paso se agregan ARNa como trazadores. La tercera etapa implica la unión de la proteína cas9 y dirigirla para escindir el segmento de ADN. La proteína Cas9 se une a una forma combinada de crRNA y tracrRNA formando un complejo efector. Esto actúa como guía de ARN para la proteína cas9 dirigiéndola por su actividad endonucleasa. [4]
Mutagénesis de ARN
Un método importante de regulación de genes es la mutagénesis de ARN que puede introducirse mediante la edición de ARN con la ayuda de gRNA. El ARN guía reemplaza la adenosina con inosina en el sitio objetivo específico y modifica el código genético. [5] La adenosina desaminasa actúa sobre el ARN y produce una modificación postranscripcional al alterar los codones y las diferentes funciones de las proteínas. Los ARN guía son los ARN nucleolares pequeños, estos junto con las riboproteínas realizan alteraciones del ARN intracelular como la ribometilación en el ARNr y la introducción de pseudouridina en el ARN preribosómico. Los ARN guía se unen a la secuencia de ARN antisentido y regulan la modificación del ARN. Se observa que el ARN interferente pequeño (ARNip) y el ARN micro (miARN) se utilizan generalmente como secuencia de ARN diana y las modificaciones son comparativamente fáciles de introducir debido a su pequeño tamaño.
Ver también
Referencias
- ^ a b Blum, B .; Bakalara, N .; Simpson, L. (26 de enero de 1990). "Un modelo para la edición de ARN en las mitocondrias de cinetoplastidos:" guía "Las moléculas de ARN transcritas de ADN maxicírculo proporcionan la información editada". Celular . 60 (2): 189-198. doi : 10.1016 / 0092-8674 (90) 90735-w . ISSN 0092-8674 . PMID 1688737 .
- ^ a b Connell, Gregory J .; Byrne, Elaine M .; Simpson, Larry (14 de febrero de 1997). "Guía de inserción de uridina independiente del ARN y dependiente del ARN guía en el ARNm del citocromo b en un lisado mitocondrial de Leishmania tarentolae PAPEL DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ARN" . Revista de Química Biológica . 272 (7): 4212–4218. doi : 10.1074 / jbc.272.7.4212 . ISSN 0021-9258 . PMID 9020135 .
- ^ Maslov, Dmitri A. (octubre de 2010). "Conjunto completo de ARNm mitocondriales paneditados en Leishmania mexicana amazonensis LV78" . Parasitología molecular y bioquímica . 173 (2): 107-114. doi : 10.1016 / j.molbiopara.2010.05.013 . ISSN 0166-6851 . PMC 2913609 . PMID 20546801 .
- ^ Karvelis, Tautvydas; Gasiunas, Giedrius; Miksys, Algirdas; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (1 de mayo de 2013). "CrRNA y tracrRNA guían la interferencia de ADN mediada por Cas9 en Streptococcus thermophilus" . Biología del ARN . 10 (5): 841–851. doi : 10.4161 / rna.24203 . ISSN 1547-6286 . PMC 3737341 . PMID 23535272 .
- ^ Fukuda, Masatora; Umeno, Hiromitsu; Nariz, Kanako; Nishitarumizu, Azusa; Noguchi, Ryoma; Nakagawa, Hiroyuki (2 de febrero de 2017). "Construcción de un ARN guía para mutagénesis de ARN dirigida al sitio utilizando edición de ARN intracelular A-to-I" . Informes científicos . 7 : 41478. Bibcode : 2017NatSR ... 741478F . doi : 10.1038 / srep41478 . ISSN 2045-2322 . PMC 5288656 . PMID 28148949 .
Otras lecturas
- Guía de edición de ARN de inserción de uridina dirigida por ARN in vitro http://www.jbc.org/content/272/7/4212.full
- Blum, Beat; Simpson, Larry (1990). "Los ARN guía en las mitocondrias de cinetoplastidos tienen una cola de oligo (U) 3 'no codificada involucrada en el reconocimiento de la región preeditada". Celular . 62 (2): 391–397. doi : 10.1016 / 0092-8674 (90) 90375-O . PMID 1695552 .
- Kurata, Morito; Wolf, Natalie K .; Lahr, Walker S .; Weg, Madison T .; Kluesner, Mitchell G .; Lee, Samantha; Hui, Kai; Shiraiwa, Masano; Webber, Beau R .; Moriarity, Branden S. (2018). "Ingeniería del genoma altamente multiplexado utilizando matrices de gRNA CRISPR / Cas9" . PLOS ONE . 13 (9): e0198714. Código bibliográfico : 2018PLoSO..1398714K . doi : 10.1371 / journal.pone.0198714 . PMC 6141065 . PMID 30222773 .
- Khan, Fehad J .; Yuen, Garmen; Luo, Ji (2019). "Knockout del gen CRISPR / Cas9 multiplexado con crRNA simple: cotransfección de tracrRNA" . Células y biociencias . 9 : 41. doi : 10.1186 / s13578-019-0304-0 . PMC 6528186 . PMID 31139343 .
- Nishimasu, Hiroshi; Nureki, Osamu (2017). "Estructuras y mecanismos de nucleasas efectoras guiadas por ARN CRISPR" . Opinión actual en biología estructural . 43 : 68–78. doi : 10.1016 / j.sbi.2016.11.013 . PMID 27912110 .
- Chuai, Guohui; Ma, Hanhui; Yan, Jifang; Chen, Ming; Hong, Nanfang; Xue, Dongyu; Zhou, Chi; Zhu, Chenyu; Chen, Ke; Duan, Bin; Gu, Feng; Qu, Sheng; Huang, Deshuang; Wei, Jia; Liu, Qi (2018). "DeepCRISPR: diseño de ARN de guía CRISPR optimizado por aprendizaje profundo" . Biología del genoma . 19 (1): 80. doi : 10.1186 / s13059-018-1459-4 . PMC 6020378 . PMID 29945655 .